响应面法优化超声辅助提取红皮云杉多酚工艺

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(1.东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨 150040； 2.黑龙江省质量监督检测研究院,黑龙江哈尔滨 150020； 3.哈尔滨工业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150090)

响应面法优化超声辅助提取红皮云杉多酚工艺

周芳1,2,赵鑫1,宫婕1,刘海鹏1,王振宇1,3，*

(1.东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨 150040； 2.黑龙江省质量监督检测研究院,黑龙江哈尔滨 150020； 3.哈尔滨工业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150090)

采用响应面法优化超声波辅助提取红皮云杉多酚工艺。在单因素实验的基础上,选择料液比、超声波功率、提取时间为自变量,以多酚得率为响应值,采用Box-Benhnken法设计三因素三水平的响应分析实验。结果表明,回归模型拟合度高,最佳工艺条件为：料液比1∶33、超声波功率301W、提取时间2.4h,乙醇浓度40%,温度60℃。在此条件下,红皮云杉多酚的得率为18.92%。

红皮云杉,多酚,超声波,响应面

红皮云杉(PiceakoraiensisNakai)是松科云杉属常绿乔木,分布于大、小兴安岭、完达山及张广才岭,吉林长白山等地。松科植物中含有萜类、多酚类、生物碱等多种生物活性成分[l],具有抗氧化、抗病毒及抗菌等生物活性[2-3]。植物多酚,习惯称单宁或鞣质,广泛存在于植物体的叶、木、皮、壳和果肉中,许多针叶树皮中植物多酚含量高达20%～40%[4]。植物多酚作为一类储存丰富可再生的绿色资源,可作为高附加值的精细化工原料,随着许多新用途的发现,尤其是许多新型的医药,农药以此为原料,因此国内外需求量逐年上升,目前已成为国内热点的精细化工原料[5]。超声波可产生机械破碎和空化作用,使细胞破碎,加速浸提物从原料向溶剂的扩散,与传统浸提法相比,具有提取效率高、温度低、能耗低、提取时间短等特点[6-7]。本文采用响应面法优化超声波辅助提取红皮云杉多酚的工艺,旨在为红皮云杉的深入研究和工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

红皮云杉球果 采自长白山；无水乙醇、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯 天津市富宇精细化工有限公司,无水碳酸钠 天津市恒兴化学试剂制造有限公司；没食子酸 SIGMA公司；福林酚试剂 天津市东丽区天大化学试剂；所用化学试剂均为分析纯。

高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器公司；T6紫外可见分光光度计 北京普析通用公司；KQ-500DE型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；NDJ-1电热恒温水浴锅 北京医疗电子仪器厂；电子天平 上海精天电子仪器厂；TDL-5台式离心机 上海科兴仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 多酚提取工艺过程 红皮云杉球果→干燥→粉碎(40目)→除脂→干燥→超声辅助提取→离心→取上清液→定容并测量吸光度→计算多酚得率

1.2.2 标准曲线的绘制 分别准确量取没食子酸标样(材料中没有列出)溶液(100μg/mL)0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35mL于10mL比色管中,加蒸馏水至2mL,摇匀后加入1.0mL福林酚(材料中没有列出)试剂,4min后加入1.0mL 10%的碳酸钠溶液,25℃水浴下保持2h后,在765nm处测定吸光度值,得标准曲线回归方程为：y=0.0214x+0.0033,R2=0.9992。

1.2.3 红皮云杉多酚得率的测定 准确吸取1mL红皮云杉球果提取液于10mL比色管中,加蒸馏水至总体积为2mL。加入1.0mL福林酚试剂后摇匀,4min后加入1.0mL 10%碳酸钠溶液,25℃水浴下保持2h后,在765nm处测定吸光度值。将吸光度值代入标准曲线方程,计算样品中多酚的得率。

式中：Y-多酚得率(%),A-吸光值,b-标准曲线截距,N-稀释倍数,V-溶剂体积(mL),a-标准曲线斜率,M-红皮云杉球果粉末质量(g)。

1.2.4 单因素实验 通过单因素实验,分别考察料液比、乙醇浓度、提取时间、提取温度、超声波功率对红皮云杉多酚得率的影响。

1.2.4.1 料液比对多酚得率的影响 精确称取6份2.00g的红皮云杉球果粉末,在乙醇浓度为40%、超声波功率为250W、提取温度为50℃、提取时间为2h的条件下,料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60。

1.2.4.2 乙醇浓度对多酚得率的影响 精确称取6份2.00g的红皮云杉球果粉末,在料液比为1∶20、超声波功率为250W、提取温度为50℃、提取时间为2h的条件下,乙醇浓度分别为0%、20%、40%、60%、80%、100%。

1.2.4.3 提取时间对多酚得率的影响 精确称取6份2.00g的红皮云杉球果粉末,在料液比为1∶20、乙醇浓度为40%、超声波功率为250W、提取温度为50℃的条件下,提取时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h。

1.2.4.4 提取温度对多酚得率的影响 精确称取6份2.00g的红皮云杉球果粉末,在料液比为1∶20、乙醇浓度为40%、超声波功率为250W、提取时间为2h的条件下,提取温度分别为30、40、50、60、70、80℃。

1.2.4.5 超声波功率对多酚得率的影响 精确称取6份2.00g的红皮云杉球果粉末,在料液比为1∶20、乙醇浓度为40%、提取温度为50℃、提取时间为2h的条件下,超声波功率分别为200、250、300、350、400、450W。

1.2.5 响应面法实验设计 在单因素实验的基础上,以料液比、超声功率、超声时间三个因素为自变量,以多酚得率为响应值,采用Box-Behnken设计法优化多酚提取工艺条件,分析软件为Statistica 6.0。设计三因素三水平响应分析实验,中心点实验重复5次,实验的因素水平编码见表1。

表1 响应面分析因素和水平表

2 结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1 料液比对多酚得率的影响 由图1可知,在料液比在1∶10～1∶30时,随料液比的增加,多酚得率也增加,且基本呈正相关关系,在料液比为1∶30时,多酚得率最高；在料液比为1∶30～1∶60时,随料液比的增加,多酚得率有所下降。由增加浓度梯度可增加提取效果[8],因而提高料液比有利于多酚的提取,但当料液比达到某一限度时,再提高料液比则相当于对多酚溶液的稀释,降低了浓度梯度,同时,更多的溶剂也可能消耗了超声波的能量,所以多酚得率反而有所下降。因此,选择料液比为1∶30左右进行后续优化实验。

图1 料液比对多酚得率的影响

2.1.2 乙醇浓度对多酚得率的影响 乙醇具有浸提选择性好、对植物细胞的穿透能力强、浸出率高、提取时间短、溶解出的杂质少、提取物不易霉变、且毒性小等优点[9]。由图2可知,在乙醇浓度为0～40%时,随着乙醇浓度的增加,多酚得率随之增加,且基本呈正相关关系,乙醇浓度为40%,多酚得率最高；继续增加乙醇浓度,多酚得率明显下降,这可能是因为乙醇浓度为40%时,与红皮云杉多酚的极性最为相近,多酚的溶解度最大。因此,最终选择乙醇浓度为40%。

2.1.3 提取时间对多酚得率的影响 由图3可知,在提取时间为0.5～1h时,随着提取时间的增加,多酚得率明显增加,且基本呈正相关关系；在提取时间为1～2h时,多酚得率增加较缓,在2h时,多酚得率已达到较高水平；在提取时间为2～3h时,多酚得率增加不明显,多酚的提取量已经达到饱和。因此,选择提取时间为2h左右进行后续优化实验。

图2 乙醇浓度对多酚得率的影响

图3 提取时间对多酚得率的影响

2.1.4 提取温度对多酚得率的影响 由图4可知,在提取温度为30～60℃时,随着提取温度的增加,多酚得率明显增加,且基本呈正相关关系,提取温度为60℃,多酚得率最高；在提取温度为60～80℃时,多酚得率有所下降。多酚中含有大量的酚羟基,化学性质比较活泼,在一定的温度范围内,提高温度有利于多酚的提取,但是在较高的温度下,多酚会变得很不稳定。Antolovich[10]的研究也发现,当温度达到60℃后,多酚的提取量显著下降。因此,最终选择提取温度为60℃。

图4 提取温度对多酚得率的影响

2.1.5 超声波功率对多酚得率的影响 由图5可知,在超声波功率为200～300W时,随着超声波功率的增加,多酚得率明显增加,且基本呈正相关关系,在超声波功率为300W时,多酚得率最高；在超声波功率为300～450W时,多酚得率明显下降,且基本呈负相关关系。随着超声波功率的增加,在单位时间内所产生的空化作用增多,热效应增大,出现更为明显的湍动效应和局部微搅动效应,有利于多酚的提取,但是在功率超过300W后,过高的声强使溶液温度升高过快,多酚有所损失,反而不利于多酚的提取。因此,选择超声波功率为300W左右进行后续优化实验。

图5 超声波功率对多酚得率的影响

2.2响应面法优化提取工艺条件

2.2.1 响应面实验设计及结果 根据Box-Behnken实验设计原理,在单因素实验的基础上,选择料液比、超声波功率、提取时间3个因素,进行三因素三水平的响应面实验设计,共17个实验点,实验结果见表2。

表2 响应面实验设计及结果

2.2.2 数学模型的建立及显著性检验 对所得数据进行多元回归拟合,方差分析结果见表3,得到的回归模型为：

Y=18.744+0.675X1-0.095X2+0.575X3-0.025X1X2-0.045X1X3+0.09X2X3-1.182X12-0.477X22-0.317X32

由表3可知,回归模型的显著性水平p<0.0001,达到极显著水平；失拟项p=0.556>0.05,影响不显著,且相关系数R2=0.9954,表明实测值与预测值高度相关。综上所述,建立的回归模型拟合度高,可用该模型较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。因此,可用该模型预测红皮云杉多酚的提取工艺条件。

表3 回归模型方差分析

注：*表示差异显著(p<0.05),**表示差异极显著(p<0.01)。

回归模型显著性检验结果见表4。t检验结果表明,料液比、提取时间的一次项和二次项、超声波功率的二次项对多酚得率的影响极显著,超声波功率的一次项对多酚得率的影响显著,而交互项对多酚得率的影响不显著。各因素对多酚得率影响程度大小顺序为：料液比>提取时间>超声波功率。

表4 回归模型显著性检验

注：*表示差异显著(p<0.05),**表示差异极显著(p<0.01)。

2.2.3 响应面优化与验证实验 利用Statistica 6.0软件,绘制各因素对红皮云杉多酚得率影响的响应曲面图,结果见图6～图8。如果一个响应曲面的坡度较平缓,表明随着处理条件的变化,响应值变化较小；而如果一个响应曲面的坡度较陡峭,表明随着处理条件的变化,响应值变化较大。

由图6可知,响应面的坡度较陡,表明料液比与超声波功率的交互作用对多酚得率有较大影响,从等高线的疏密度可以判断出,料液比对响应值的影响大于超声波功率。

图6 料液比和超声波功率对多酚得率影响的响应面图

图7 料液比和提取时间对多酚得率影响的响应面图

图8 超声波功率和提取时间对多酚得率影响的响应面图

由图7可知,响应面的坡度也较陡,表明料液比与提取时间的交互作用对多酚得率有较大影响,从等高线的疏密度可以判断出,料液比对响应值的影响大于提取时间。

由图8可知,响应面的坡度较平缓,表明超声波功率与提取时间的交互作用对多酚得率的影响较小,从等高线的疏密度可以判断出,提取时间对响应值的影响大于超声波功率。

综上所述,料液比对多酚得率的影响最大,提取时间次之,超声波功率的影响较小。通过计算,得到的最佳工艺条件为：料液比为1∶32.69、超声波功率为301.16W、提取时间为2.44h。在此条件下,红皮云杉多酚的得率为19.09%。考虑到实际操作条件,将条件修正为料液比1∶33、超声波功率301W、提取时间2.4h。在此条件下,进行验证实验,实际测得的得率为18.92%,实测值与预测值相对误差<1%,说明回归模型拟合度高,可用于优化红皮云杉多酚的提取工艺条件,具有实用价值。

3 结论

本实验在单因素实验的基础上,采用响应面分析法对红皮云杉多酚的提取工艺条件进行了优化。结果表明,料液比、超声波功率、提取时间对红皮云杉多酚得率均有显著影响,最佳工艺条件为：料液比1∶33、超声波功率301W、提取时间2.4h,乙醇浓度40%,温度60℃。验证实验结果表明,红皮云杉多酚的得率为18.92%,回归模型拟合度高,可用于优化红皮云杉多酚的提取工艺条件,具有实用价值。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction conditions of polyphenol fromPiceakoraiensisNakaiby response surface methodology

ZHOUFang1,2,ZHAOXin1,GONGJie1,LIUHai-peng1,WANGZhen-yu1,3，*

(1. School of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China; 2. The Academy of Quality Inspection and Research in Hei Long Jiang Province,Harbin 150020,China； 3. School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China)

The ultrasonic-assisted extraction conditions of polyphenol fromPiceakoraiensiswere optimized by response surface methodology. Based on single factor test,a 3-factor,3-level Box-Behnken experimental was adopted,including dependent variables(ratio of material to liquid,ultrasonic wave power and extraction time)and independent variable(yield of polyphenols). The results showed that the regression model fit well with experimental data. The optimum conditions were ratio of material to liquid 1∶33,ultrasonic wave power 301W,extraction time 2.4h,ethanol concentration 40%,extraction temperature 60℃. Under these conditions,the yield of polyphenol was 18.92%.

PiceakoraiensisNaka;polyphenol;ultrasonic wave;response surface methodology

2013-06-17 *通讯联系人

周芳 (1981-),女,博士,工程师,研究方向：植物资源开发及植物活性成分研究。

国家自然科学基金资助项目(31170510)。

TS201.1

：B

：1002-0306(2014)01-0210-05