微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定菠萝蛋白酶中无机元素的含量

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(1.中国热带农业科学院农产品加工研究所,广东湛江 524001； 2. 国家农业标准化与监测中心,安徽合肥 230061)

微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定菠萝蛋白酶中无机元素的含量

叶剑芝1,韩志萍1,苏子鹏1,谭炜2,王明月1,杨春亮1,*

(1.中国热带农业科学院农产品加工研究所,广东湛江 524001； 2. 国家农业标准化与监测中心,安徽合肥 230061)

建立微波消解-电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定菠萝蛋白酶中25种无机元素的方法。采用在线内标校正基体效应和信号漂移,干扰方程校正Co和Ni,CCT测定Se。加标回收率在82.2%～113.0%之间,RSD在0.55%～4.94%之间,乳粉标准样品测定值均在标准值内。结果表明本法可用于菠萝蛋白酶中25种无机元素含量的测定。测定结果显示,菠萝蛋白酶中含有大量的人体必需元素；有害元素Pb、Cd、Cr、As含量(mg/kg)分别为：0.75,0.035,7.2,2.4,Hg未检出,可保证最终产品食用安全；对菠萝蛋白酶品质有影响的元素Mg、Mn、Ca、Zn、Fe和Cu含量(mg/kg)分别为：150,53,1700,4.1,1000,3.2,其中Fe含量高于20mg/kg,需改进工艺降低其含量。测定结果为科学利用菠萝蛋白酶提供参考依据。

菠萝蛋白酶,电感耦合等离子体质谱,无机元素,微波消解

我国是菠萝十大主产国之一,种植区域主要分布在广东、海南、广西等热区省[1]。菠萝除果肉用于鲜食和加工成菠萝罐头、果汁等产品外,其加工副产物还被开发成菠萝蛋白酶、菠萝纤维、菠萝凉果和菠萝生物有机肥等[2-3]。菠萝蛋白酶是从菠萝果肉、皮渣和茎中提取出来的一种蛋白水解酶系,属巯基蛋白酶,具有很强的水解活性[1,4]。菠萝蛋白酶普遍应用于食品、化工、医药和美容保健行业。尤其在医药行业,具有消炎、抗血栓、消水肿的作用,可用于术后消肿和减痛,同时具有促消化、抗癌、增进药物吸收等多种功效。人体必需的无机矿质元素大多以络合物形式存在于人体之中,起到调节人体新陈代谢的作用。少数有毒金属元素如Pb、Cd、Cr、Hg、As等,则有致癌性。有些元素如Se,是一种重要的微量元素,具有抗癌、抗疾病、抗衰老的作用,但摄入量过大,则会引起中毒[5]。金属元素如Mg、Mn、Ca、Zn、Fe和Cu则对菠萝蛋白酶的活性和热稳定性[6-7]有明显的影响。这些无机元素一部分来自菠萝本身,另一部分来自食品加工过程的接触材料。监控菠萝蛋白酶中各类无机元素的含量情况,一方面可保证产品质量安全,另一方面可为优化工艺提高产品品质提供依据。微波消解技术以其高效、快速、平行性好等独特优点,广泛应用于各种元素分析的样品前处理[8]。ICP-MS能够同时快速监测多种微量元素,线性范围宽,检出限低[9]。国内外关于利用微波消解-ICP-MS检测菠萝蛋白酶中无机元素含量的方法还未见报道。本文建立一种微波消解-ICP-MS法,快速、精确测定菠萝蛋白酶中25种无机元素含量的分析方法。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

HNO3(65%)优级纯 德国Merck；H2O2(30%)优级纯 德国Merck；高纯氩气纯度为99.999%；氢氦混合气(高纯氢占7.12%)；实验用水为超纯水(18.2MΩ)；混合调谐液Li、Co、In、U为10mg/L 美国O2si；Re为1000mg/L 国家有色金属及电子材料分析测试中心；Na、Mg、Al、P、K、Ca、Ti、V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Sr、Cd、Ba、Hg、Pb、Fe、Se、Sc、Ge、In,Rh为1000mg/L 国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院；Sn,Sb为500mg/L 国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院；Au为100μg/g 中国计量科学研究院；奶粉GBW10017 地球物理地球化学勘察研究所。

菠萝蛋白酶 干粉,卡因菠萝中提取,酶活力1.0×106U/g,徐闻县众缘生物科技有限公司提供。

ICP-MS ThermoFisher Scientific X series Ⅱ,美国；微波消解仪 CEM MARS,美国；超纯水发生器 Milli-Q Element,Millipore,法国；微波消解仪 安南DV4000,北京。

1.2实验方法

1.2.1 样品前处理方法 称取约0.5000g样品,加入0.0200gAu标液,6.00mL硝酸,2.00mL双氧水,摇匀,90℃预消解2h后放冷至室温加盖,密封微波消解,消解条件见表1。消解程序结束后,冷却至室温,超纯水清洗3次转移至50.00mL比色管,定容,然后稀释到合适浓度,摇匀静置,上机检测,同时做空白实验。标准物质、菠萝蛋白酶及加标回收均做六个平行样。

表1 微波消解工作程序

1.2.2 ICP-MS工作条件 开机优化,将Li、Co、In、U信号值调到最大,双电荷和氧化物干扰降到3.0%以下,采样深度为150mm,水平为16mm,垂直为285mm,冷却气为13.02L/min,辅助气为0.8L/min,雾化气为0.93L/min,六级杆偏压为-0.9V,采用CCT技术时,混合气体为氢+氦,比例为7∶93,气体流量为4.5mL/min。高含量和高灵敏度的元素采用float模式。每个元素扫描100次,停留时间10ms,通道3,通道间隔0.02AMU。

2 结果与分析

2.1同位素的选择及干扰校正

在ICP-MS分析中,通过选择待测元素合适的同位素、方程校正或者CCT技术可以最大程度地避免质谱干扰。确定各待测元素同位素及丰度(%)为：23Na(100)、24Mg(78.6)、27Al(100)、31P(100)、39K(93.1)、44Ca(2.13)、47Ti(7.75)、51V(99.8)、52Cr(83.8)、56Fe(91.5)、55Mn(100)、59Co(100)、60Ni(26.2)、65Cu(30.9)、66Zn(27.8)、69Ga(60.2)、75As(100)、88Sr(82.6)、111Cd(12.9)、118Sn(24.0)、121Sb(57.2)、137Ba(11.3)、202Hg(29.8)、208Pb(52.4)、80Se(79.9)；其中80Se采取CCT模式[10]；Co、Ni采用方程校正,Co=59Co-[0.001×43Ca],Ni=60Ni-[0.003×43Ca][11]。

为保护检测器,根据元素的含量和灵敏度情况,Ca、Mg、Al、Na、P、K、V、Cr、Mn、Sr、Fe采用float模式,并采用了高分辨率。

为克服样品基体效应等影响,在线加入Sc、Ge、Rh、In、Re混合内标对结果进行校正。

Hg2+的吸附能力较强,在用ICP-MS测定Hg含量时,为减小记忆效应对测定结果准确度的影响,在样品中加入100μg/g Au 0.0200g[12]。

2.2工作曲线与检出限

Ca、Mg、Al、Na、P、K、V、Cr、Mn、Sr、Fe配一组混标,Ti、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Cd、Sn、Sb、Ba、Hg、Pb配一组混标,Se单独配一组标液。各元素工作曲线由0到最高浓度等间距的6个浓度值组成,最高浓度值见表2。

空白溶液重复测定10次,取3倍标准偏差所对应浓度为方法检出限。线性范围、相关系数及方法检出限见表2。

表2 各元素线性范围、相关系数和检出限

表3 方法的准确度和精密度(n=6)

表4 方法的准确度和精密度(n=6)

2.3标准物质分析和加标回收率

为验证本方法的准确性和可靠性,在选择的实验步骤和操作条件下对国家标准物质奶粉GBW10017进行测定,结果见表3,测定值均在标准值范围内,RSD在0.97%到4.92%之间。

加标回收实验的平均回收率和RSD值见表4,回收率在82.2%到113.0%之间,RSD在0.55%到4.94%之间。

2.4样品分析结果

测定菠萝蛋白酶中25种无机元素的含量见表5。

结果表明菠萝蛋白酶中含丰富的人体必需元素如K、Ca、Na、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu、Se等,含量10mg/kg以上的无机元素及其排序为Na>K>Ca>Al>Fe>P>Mg>Mn>Ti。对菠萝蛋白酶的活性和热稳定性有影响的元素Mg、Mn、Ca、Zn、Fe和Cu含量(mg/kg)分别为：150,53,1700,4.1,1000,3.2。对人体有害的重金属Pb、Cd、Cr、As含量(mg/kg)分别为：0.75,0.035,7.2,2.4,Hg未检出,根据菠萝蛋白酶活力情况,需要稀释20倍使用,所以最终产品中Pb、Cd、Cr、As的含量(mg/kg)分别不超过：0.038,0.0094,0.36,0.12。

表5 样品分析结果

3 结论

3.1 采用加6.00mL硝酸、2.0mL双氧水消解体系的微波消解-ICP-MS法测定了菠萝蛋白酶中的Na,Mg,Al,P,K,Ca,Ti,V,Cr,Mn,Fe,Co,Ni,Cu,Zn,Ga,As,Se,Sr,Mo,Cd,Sn,Sb,Ba,Pb等25种无机元素的含量,快速、高效,工作曲线在各自线性范围内的相关系数均在0.997以上,回收率在82.2%到113.0%之间,相对标准偏差均在4.94%以下,标准物质测定值在标准值范围之内,并得出各自较低的检出限,满足实验室检测要求。

3.2 含丰富的人体必需元素如K、Ca、Na、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu、Se等,含量10mg/kg以上的无机元素及其排序为Na>K>Ca>Al>Fe>P>Mg>Mn>Ti；最终产品有害重金属元素Pb、Cd、Cr、As和Hg含量均符合较严格的GB 2762-2012食品中污染物限量的要求；得出影响酶活力及稳定性的Mg、Mn、Ca、Zn、Cu和Fe含量,其中Fe含量高于20mg/kg,用于医药行业时,需要进一步优化工艺加以去除,测定结果为菠萝蛋白酶的进一步应用提供基础数据。

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Determination of the contents of inorganic elements in bromelain by microwave digestion-inductively coupled plasma mass spectrometry

YEJian-zhi1,HANZhi-ping1,SUZi-peng1,TANWei2,WANGMing-yue1,YANGChun-liang1,*

(1.Agricultural Product Processing Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Zhanjiang 524001,China;2.National Center of Agricultural Standardization and Supervision,Hefei 230061,China)

A method was established for determining 25 inorganic elements in bromelain by microwave digestion-inductively coupled plasma mass spectrometry(ICP-MS). Internal standard solution online was used to correct matrix effect and signal drift. Interference equation was used to correct the contents of Co and Ni. CCT was used to determinate Se. The recovery percentage ranged from 82.2% to 113.0%. The RSD ranged from 0.55% to 4.94%. It could be concluded that the method could be applied to determine 25 inorganic elements in bromelain. The analysis results of milk powder standard samples were in the range of standard value. It showed that essential elements of body were rich in bromelain;the contents(mg/kg)of harmful elements Pb,Cd,Cr,As were 0.75,0.035,7.2,2.4mg/kg respectively and Hg was not detected,which could ensure the safety of the finally product. The contents(mg/kg)of harmful elements Mg,Mn,Ca,Zn,Fe and Cu were 150,53,1700,4.1,1000,3.2mg/kg respectively in bromelain. The content of Fe was higher than 20mg/kg. Therefore it is in urgent to reduce its containment by the optimizing of process. The determination results supplied the reference for scientific use of bromelain.

bromelain;inductively coupled plasma mass spectrometry;inorganic element;microwave digestion

2013-05-28 *通讯联系人

叶剑芝(1981-),男,硕士研究生,助理研究员,研究方向：生物资源综合利用及农产品质量安全。

海南省自然科学基金(311067)。

TS201.2

：A

：1002-0306(2014)01-0295-04