响应面法优化BacillusamyloliquefaciensZJHD-06产类细菌素发酵培养基

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(广东省水产品加工与安全重点实验室,广东省普通高等学校水产品深加工重点实验室,广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524000)

响应面法优化BacillusamyloliquefaciensZJHD-06产类细菌素发酵培养基

安俊莹,刘颖*,朱雯娟,胡雪琼,叶莉珍

(广东省水产品加工与安全重点实验室,广东省普通高等学校水产品深加工重点实验室,广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524000)

以分离自海洋宝石石斑鱼肠道的一种解淀粉芽孢杆菌ZJHD-06所产类细菌素为研究对象,以单核增生李斯特菌为抗菌活性测试指示菌,以抑菌圈直径大小为指标,采用响应面法对菌株ZJHD-06产类细菌素的发酵培养基成分进行优化。通过Plackett-Burman 实验筛选出对类细菌素产量具有显著影响的因素,再通过最陡爬坡实验确定显著因素的中心水平,最后进行Box-Behnken实验设计,最终得到的最佳配比为葡萄糖浓度4.80%,蛋白胨浓度0.47%,酵母浸膏浓度0.44%,NaCl、K2HPO4和MgSO4·7H2O浓度分别为1.0%、0.01%、0.03%。在该培养基配比下,发酵上清液的抑菌圈直径增加了27.8%。

响应面,类细菌素,发酵培养基

细菌素是某些细菌在代谢过程中,通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽、蛋白质或蛋白质复合物,但它通常具有较窄的抑菌谱,只能杀死或抑制与其亲缘关系近的其他微生物[1-2],这一性质使它的应用受到了一定的限制。随着对细菌素研究的不断深入,研究者发现了一些不符合或是完全不符合细菌素定义的蛋白类拮抗物质,不仅能抑制革兰氏阳性菌还能抑制革兰氏阴性菌和真菌,并被称之为类细菌素[3]。由于它们具有高效、无毒、无残留,并且能有效地抑制食品腐败菌与致病菌的生长,近年来,它们作为有潜力的、结构新颖的天然食品防腐剂得到了广泛的研究[4]。目前,虽然已经有乳酸菌、链霉菌、铜绿假单胞菌、芽孢杆菌属[5-8]等产生类细菌素的报道,但是受化学结构和作用机理不明确、产量低、生产成本高等因素的制约,真正实现工业应用的类细菌素只有乳酸链球菌素(Nisin)[9]。提高产量成为工业应用要解决的关键问题之一。微生物的生长和代谢产物的积累受培养基的组分如碳源、氮源、生长因子、无机盐等多种因子的影响,因此优化发酵培养基成分是一个提高类细菌素产量的有效办法[10]。响应面法(response surface methodology,RSM)是利用合理的实验设计,建立多元二次方程模型来拟合因素和响应值之间的函数关系,通过对回归方程的分析来寻求最优工艺,解决多变量问题的一种统计学方法,该法被广泛应用于农业、生物、食品、化工等领域[11]。本研究利用响应面法对从海洋宝石石斑鱼肠道中分离得到一株产类细菌素的解淀粉芽孢杆菌ZJHD-06(BacillusamyloliquefaciensZJHD-06)的发酵培养基进行优化,以提高类细菌素的产量,为新型天然食品防腐剂的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

解淀粉芽孢杆菌ZJHD-06(BacillusamyloliquefaciensZJHD-06) 本实验室分离得到；单核增生李斯特菌(ListeriamonocytogenesATCC 35152) 广东省微生物研究所提供；营养肉汤(NB)、胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA)、胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤(TSB) 北京陆桥技术责任有限公司。

YXQ-LS-50SI立式压力蒸汽灭菌器、SPX-150B-Z恒温培养箱、SW-CJ-2F超净工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；HZQ-R恒温摇床 东联电子技术开发有限公司；3-18K冷冻离心机 Sigma公司。

1.2实验方法

1.2.1 菌种发酵及上清液的制备 采用营养肉汤培养基将B.amyloliquefaciensZJHD-06连续活化2代,每代30℃、200r/min下培养12h。活化后菌液按3%接种量接种至每个实验培养基(50mL/250mL锥形瓶),30℃、200r/min下培养72h。将各发酵液于12000r/min 4℃离心15min,收集上清液,并用0.22μm的滤膜过滤,滤液的pH调至7.0,4℃下保存备用。

1.2.2 Plackett-Burman实验设计 对影响发酵结果的培养基中的碳源(葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉),氮源(蛋白胨、酵母浸膏、黄豆粉、绿豆粉),无机盐(NaCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O)三大营养因子进行考察,采用Plackett-Burman法设计11因素2水平的实验,以抑菌圈直径为响应值,筛选影响类细菌素产量的主效因素,实验因素水平及编码见表1。实验设计中低水平(-1)与高水平(1)的浓度是在菌株筛选时发酵培养基成分的基础上经过预实验所得。

表1 Plackett-Burman设计的因素水平及编码

1.2.3 最陡爬坡实验 以实验结果即抑菌圈直径变化的梯度方向为爬坡方向,根据各因素效应值的大小确定变化步长,能快速、经济的逼近最佳区域。根据Plackett-Burman实验得出的结果安排最陡爬坡实验,实验安排见表5。

1.2.4 Box-Behnken实验设计 经Plackett-Burman实验确定的主效因素作为设计因素,最陡爬坡实验确定的最优水平作为中心水平,设计Box-Behnken实验,实验因素水平及编码见表2。

表2 Box-Behnken实验因素水平及编码

1.2.5 类细菌素抗菌活性测定 指示菌悬液的制备：将L.monocytogenes按1%的接种量接种到用胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤37℃培养12h,之后用生理盐水稀释至OD600=0.6,4℃保存。

牛津杯双层平板法[12]：先向灭菌平皿中加入约5mL素琼脂,凝固后摆放已灭菌的牛津杯,再向平皿内加入含有指示菌菌悬液的胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂,凝固后取出牛津杯,向孔内加入100μL的发酵上清液,4℃下扩散2h后37℃培养24h,用游标卡尺测量抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1影响类细菌素产量的主效因素的确定

本实验采用N=12的Plackett-Burman实验设计,用JMP7.0软件对实验数据进行分析。Plackett-Burman实验安排及结果见表3。

根据分析各因素对响应值显著性检验结果的p值来判断各因子对实验影响的程度,见表4。由表4可知,葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏三个因素为主效因子(p<0.05),它们对类细菌素产量影响显著,尤其是葡萄糖(p<0.01)对类细菌素产量影响极显著。因为无机盐是微生物必不可少的生长因素,对于不显著的无机盐因素NaCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O在之后实验中的浓度保持低水平,分别是1.0%、0.01%、0.03%。

表3 Plackett-Burman实验安排及结果

表4 各因素对响应值的显著性检验结果

注：**代表对实验结果有极显著影响(p<0.01),*代表对实验结果有显著影响(p<0.05),表8同。

2.2最陡爬坡路径

由表4可知，葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏这三个因素对实验结果影响都为正效应,所以在最陡爬坡实验中它们的变化方向是逐渐增加的。根据这三个因素效应大小的比例设定它们的变化方向以及步长,无机盐因素分别取各自的低水平进行实验。实验设计及结果见表5,可以看出葡萄糖浓度3.0%、蛋白胨浓度0.3%、酵母浸膏浓度0.3%时实验抑菌圈直径最大,所以以3.0%、0.3%、0.3%为葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏的中心水平设计Box-Behnken实验。

2.3 Box-Behnken实验设计及结果分析

2.3.1 二次回归模型拟合及方差分析 以Plackett-Burman实验确定的葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏这三个主效因素为设计因素,以最陡爬坡实验确定的最优浓度为中心水平进行3因素3水平N=15的Box-Behnken设计,实验设计及结果见表6。

表5 最陡爬坡实验安排及结果

表6 Box-Behnken实验设计及结果

根据实验结果,运用JMP7.0软件进行二次回归分析,其回归方程为Y=21.833+1.225X1+1.186X2+1.038X3-1.379X12+1.050X1X2+0.550X1X3-1.404X22+0.375X2X3-1.354X32。

表7 回归方程的方差分析表

对回归方程的各个因素进行显著性检验的结果见表8。可知,葡萄糖浓度、蛋白胨浓度、酵母膏浓度的一次项和二次项对类细菌素的产量影响极显著,葡萄糖浓度和蛋白胨浓度的交互作用对类细菌素的产量都有显著影响。

表8 回归方程参数估计

2.3.2 响应面分析和最佳培养基配比确定 葡萄糖与蛋白胨、葡萄糖与酵母浸膏、蛋白胨与酵母浸膏之间的交互作用如图1～图3所示。

图1 葡萄糖与蛋白胨交互作用的响应面图

图2 葡萄糖与酵母浸膏交互作用的响应面图

图3 蛋白胨与酵母浸膏交互作用的响应面图

从图1～图3可以看出响应面都为开口向下的凸型曲面,说明实验存在抑菌圈直径的最大值。比较三个图可以看出图1的响应面陡峭程度最高,这说明了葡萄糖浓度和蛋白胨浓度对抑菌圈直径的交互作用最明显。这也许因为葡萄糖和蛋白胨是培养基中的主要碳源和氮源,碳源和氮源是细菌生长必不可少的因素。葡萄糖和蛋白胨的添加比例也对类细菌素的产量有着显著的影响[13]。

对简化的二次回归方程Y=21.833+1.225X1+1.186X2+1.038X3-1.379X12+1.050X1X2-1.404X22-1.354X32进行求解得出极值点为X1=0.905、X2=0.853、X3=0.685,通过计算得出对应的葡萄糖浓度为4.810%,蛋白胨浓度为0.471%,酵母浸膏浓度为0.437%,预测的抑菌圈最大直径为23.25mm。考虑到实际发酵生产,得出发酵培养基的最佳配比为葡萄糖4.80%,蛋白胨0.47%,酵母浸膏0.44%,NaCl、K2HPO4和MgSO4·7H2O保持低水平浓度分别为1.0%、0.01%、0.03%。

2.3.3 验证实验 为了验证预测值的真实性,按照考虑实际生产所得的最佳配比做了3次重复实验,实验所得的平均值为22.98mm,只比预测的抑菌圈最大直径少0.27mm,这说明预测值与真实值之间有良好的拟合度。

从验证实验结果可以看出,培养基优化后发酵上清液的抑菌圈直径有了明显的增加,这与一些文献的实验结果一致。如曹小红等[14]利用响应面法优化BacillusnattoTK-1产脂肽发酵培养基使脂肽产量提高了约30%。刘国荣等[15]利用响应面法优化弯曲乳杆菌RX-6代谢产细菌素的发酵培养基组成时得到的最佳配方使得细菌素效价增加了2.46倍。

3 结论

本文采用响应面法对B.amyloliquefaciensZJHD-06产类细菌素发酵培养基进行了优化,首先利用Plackett-Burman实验筛选出葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏这三个因素为主效因素,经过最陡爬坡实验确定3%、0.3%、0.3%为中心水平后,进行Box-Behnken实验设计,对实验结果进行分析,得出产类细菌素的培养基的最佳配比为葡萄糖4.80%,蛋白胨0.47%,酵母浸膏0.44%,NaCl、K2HPO4和MgSO4·7H2O保持低水平浓度分别为1.0%、0.01%、0.03%。运用该配比进行验证实验,抑菌圈的直径高达22.98mm,比较之前的实验结果抑菌圈直径(平均直径18.0mm)增加了27.8%。

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Optimization of fermentation medium ofBacillusamyloliquefaciensZJHD-06 by response surface methodology

ANJun-ying,LIUYing*,ZHUWen-juan,HUXue-qiong,YELi-zhen

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety,Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524000,China)

The fermentation medium ofBacillusamyloliquefacienZJHD-06 isolated from intestine ofEpinephelusareolatuswas optimized for a bacteriocin-like substance(BLS)production. Bacteriostatic circle diameter was used as evaluation index againstL.monocytogenesATCC 35152. Firstly,the notable factors were screened by Plackett-Burman experiment design. Then,the path of steepest ascent was undertaken to approach the optimal region of the significant factors. Finally,Box-Behnken design was adopted to identify optimal proportion. The results showed the optimal proportions were glucose 4.80%,peptone 0.47%,yeast extract 0.44%,NaCl 1.0%,K2HPO40.01% and MgSO4·7H2O 0.03%. The bacteriostatic circle diameter of the fermentation supernatant was increased by 27.8% using the optimal proportions.

response surface methology;bacteriocin-like substance;fermentation medium

2013-07-10 *通讯联系人

安俊莹(1988-)，女，硕士研究生，研究方向：海洋生物资源利用。

广东省自然科学基金(S2011010000328)；广东省科学技术厅(粤科规划字[2009]198号)。

TS201.1

：B

：1002-0306(2014)01-0191-05