真菌黄曲霉对氟磺胺草醚的最佳降解条件研究

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(1.东北农业大学理学院,黑龙江哈尔滨 150030； 2.东北农业大学农学院,黑龙江哈尔滨 150030)

真菌黄曲霉对氟磺胺草醚的最佳降解条件研究

崔文娟1,邹月利1,*,陶波2,*,孙宁1,赵迪1,朱美华1,张如如1

(1.东北农业大学理学院,黑龙江哈尔滨 150030； 2.东北农业大学农学院,黑龙江哈尔滨 150030)

采用高效液相色谱法测定真菌黄曲霉在不同条件下对氟磺胺草醚的降解效率,确立降解菌株黄曲霉(TZ1985)对氟磺胺草醚的最佳降解条件。结果表明：在不调节反应液pH条件下,当氟磺胺草醚的浓度为10mg/L、黄曲霉接种量为3%的菌悬母液、温度为25℃、振荡培养5d时,真菌黄曲霉菌株可以降解92.5%以上的氟磺胺草醚。

氟磺胺草醚,黄曲霉,液相色谱,降解条件

氟磺胺草醚(Fomesafen)又称虎威,是由英国捷利康公司开发的二苯醚类除草剂。化学名称为:5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-N-(甲磺酰基)-2-硝基苯甲酰胺[1-2]；氟磺胺草醚为无色晶体,是一种具有高度选择性的大豆、花生田苗后除草剂,能有效地防除大豆、花生田阔叶杂草和香附子,对禾本科杂草也有一定的防效[3]。氟磺胺草醚在土壤中持效期长,用药量偏高,对第二年种植敏感作物,如白菜、谷子、高粱、甜菜、玉米、小米、亚麻等均有不同程度药害；极大地限制了大豆和花生产区合理的作物轮作,严重影响种植结构的调整,对农业生产造成极大的损失[4-6]。除草剂在土壤中主要通过光解、水解、微生物降解等降解方式,其中微生物降解起着非常重要的作用。环境的pH、温度、湿度和土壤中的矿物质等均能影响微生物降解除草剂的除草活性[7-8]。近些年人们通过筛选和富集,分离得到的能够降解氟磺胺草醚的微生物主要是曲霉属和酵母属真菌、芽孢杆菌属细菌和链霉属放线菌[9-11]。国内外研究表明,微生物降解除草剂对环境安全、无毒,尤其是在水和土壤环境中降解效果十分显著[12-13]。实验利用科研室筛选出能够高效降解氟磺胺草醚的真菌黄曲霉(Aspergillusflavus)对在不同培养条件下的氟磺胺草醚除草剂降解特性进行深入的研究,利用高效液相色谱法定量检测,确定真菌黄曲霉对氟磺胺草醚除草剂的最佳降解条件,为生物治理该类除草剂的残留提供有效途径[14-15]。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

甲醇 美国迪马公司；二氯甲烷 科密欧公司,均为色谱纯；氟磺胺草醚标准品 购自江苏常青农药有限公司,其纯度为98.0%；真菌黄曲霉(Aspergillusflavus) 为东北农业大学农药学与杂草学教研室自行筛选、保存的高效降解菌株TZ1985。

Agilent 1260高效液相色谱仪 美国安捷伦科技发展有限公司；Z36HK超速冷冻离心机 德国HERMLE仪器公司；YGC-12D圆形氮吹仪 郑州宝晶电子科技有限公司；BS124S分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;AP-01P真空抽滤机 天津奥特赛恩斯仪器有限公司；0.22μm微孔滤膜 上海市新亚净化器件厂生产。

1.2实验方法

1.2.1 液相色谱条件的选择 高效液相色谱采用反向色谱柱：Agilent-ZORBAX SB-C18(4.6×150 mm,5.0μm)；紫外检测器的波长设定：290nm；流动相配比：甲醇和水(pH=3,用36.5% 醋酸调节)的比例为70∶30；流速：1.0mL/min；柱温设定：30℃；进样体积：10μL。

1.2.2 培养基配制的方法 PDA斜面培养基：取马铃薯200g,洗净去皮后切碎,加水煮沸30min,用斜面菌种的培养纱布过滤后加入20g葡萄糖和15g琼脂,蒸馏水1000mL,121℃高压灭菌15min。

查氏(基础)培养基：葡萄糖20g,FeSO40.01g,MgSO4·7H2O 0.5g,KCl 0.5g,NaNO32.0g,琼脂20g,K2HPO41.0g,再加入蒸馏水1000mL,在121℃条件下高温高压灭菌20min[13-14]。

1.2.3 氟磺胺草醚的标准曲线绘制 准确称量纯度为98.0%的氟磺胺草醚除草剂0.1020g于烧杯中,加入一定量的色谱甲醇溶液使之充分溶解,转移至250mL的容量瓶中,定容到刻度线,得到浓度为400.0mg/L的氟磺胺草醚标准储备液。用流动相稀释成浓度依次为：0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4、6、8、10、40、80、120mg/L氟磺胺草醚标准溶液,最后用高效液相色谱仪进行测定。

1.2.4 真菌黄曲霉最佳降解条件的确定 分别向250mL锥型瓶内装入100mL一定pH的基础培养基,在121℃条件下高温灭菌1.5h。再向基础培养基中加入一定量的氟磺胺草醚储备液,使其成为不同浓度的反应液。然后再接种一定量的黄曲霉种子液,以不加黄曲霉种子液作为对照,每组设置3个重复,将锥型瓶置于130r/min的摇床上在一定温度条件下避光振荡培养一定时间。

1.2.4.1 氟磺胺草醚的浓度对降解作用影响 分别加入氟磺胺草醚储备液,使其分别成为1、5、10、50和100mg/L浓度的反应液,进行降解实验；考察氟磺胺草醚的浓度对降解作用影响。

1.2.4.2 培养基中的温度对降解作用影响 分别在20、25、30和35℃条件下,进行降解实验；考察培养基中的温度对降解作用影响。

1.2.4.3 真菌黄曲霉的接种量对降解作用影响 分别加入1%、2%、3%、4%、5%的黄曲霉菌悬母液,进行降解实验；考察真菌黄曲霉的接种量对降解作用影响。

1.2.4.4 培养的时间对降解作用影响 每隔0、1、3、5、7、10d取样,用液相色谱仪进行检测；考察培养的时间对降解作用影响。

1.2.4.5 不同pH的培养基对降解作用影响 使基础培养基中溶液pH分别为5、7、9,以不调节pH为对照,进行降解实验；考察不同pH的培养基对降解作用影响。

1.2.5 氟磺胺草醚除草剂降解率的测定 将反应液每隔一定的时间,在无菌操作台上取样5.0mL降解液,在12000r/min、4℃条件下离心15min后取上清液3.0mL,加1.0g左右的固体氯化钠(防止乳化),摇匀、使之完全溶解后,加5.0mL(3.0+2.0)二氯甲烷萃取2次、合并有机层；加0.5g左右的无水硫酸钠干燥,取上清液用氮气吹干,用甲醇溶液定容至1.0mL。最后用0.22μm的有机微孔滤膜过滤,在高效液相色谱仪上进行测定氟磺胺草醚除草剂的降解率。

2 结果与讨论

2.1方法的线性

根据液相色谱法的测定结果,以氟磺胺草醚除草剂的浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线(如图1)。得到线形回归方程为：y=25.933x-0.867,相关系数为：R2=0.9997(n=3)。实验研究结果表明,氟磺胺草醚除草剂在0.1～120mg/L浓度范围内具有良好的线性关系。

图1 氟磺胺草醚除草剂的标准曲线

2.2真菌黄曲霉的最佳培养条件确立

2.2.1 氟磺胺草醚的浓度对降解作用影响 在基础培养基中黄曲霉接种量为3%的菌悬母液,温度为25℃,待反应液培养5d,测定不同浓度氟磺胺草醚的降解曲线(如图2)表明：真菌黄曲霉菌株在基础培养基中是以氟磺胺草醚为唯一碳源和氮源的微生物,所以对不同浓度的氟磺胺草醚的降解率存在较大差异。其中对浓度为5、10和50mg/L氟磺胺草醚的降解能力明显高于浓度为1和100mg/L氟磺胺草醚的降解率；当氟磺胺草醚含量为10mg/L时降解率最高,为92.53%。

图2 氟磺胺草醚的浓度对降解作用影响

2.2.2 培养基中的温度对降解作用影响 在基础培养基中加入浓度为10mg·L-1氟磺胺草醚,黄曲霉接种量为3%的菌悬母液,待反应液培养5d时的降解曲线(如图3)表明：不同温度对黄曲霉的降解速率影响较大,反应液的温度为20℃时,氟磺胺草醚的降解率为90.41%；当温度为25℃时降解率最高,为92.5%；所以实验选取的培养温度为25℃。以上结果表明,温度过低或者过高均会抑制该菌株对氟磺胺草醚的降解。因此,选择合适的降解温度对提高降解率具有很大意义。

图3 培养温度对降解作用影响

2.2.3 真菌黄曲霉的接种量对降解作用影响 微生物的数量是影响黄曲霉降解能力的重要因素之一,向氟磺胺草醚浓度为10.0mg·L-1的基础培养基中接种不同菌量的菌悬母液,在25℃条件下振荡培养5d时测定氟磺胺草醚的降解率,实验结果表明(如图4),当真菌黄曲霉的接种量为3%的菌悬母液时对氟磺胺草醚降解速率最大,为93.47%。

图4 真菌黄曲霉的接种量对降解作用影响

2.2.4 培养的时间对降解作用影响 在基础培养基中加入浓度为10mg·L-1氟磺胺草醚,黄曲霉接种量为3%的菌悬母液,温度为25℃,将反应液每隔0、1、3、5、7、10d测定氟磺胺草醚的降解率,实验结果表明(如图5)：培养5d时降解率为95.36%,培养10d时的降解率为98.64%。因此,黄曲霉菌株在培养到5d即可将氟磺胺草醚基本降解完全。

图5 培养的时间对降解作用影响

2.2.5 不同pH的培养基对降解作用影响 基础培养基中反应液的pH是影响氟磺胺草醚降解的一个非常重要因素。使基础培养基中温度为25℃,浓度为10mg·L-1氟磺胺草醚,黄曲霉接种量为3%的菌悬母液,将反应液每隔0、1、3、5d测定氟磺胺草醚除草剂的降解曲线(如图6)表明：在对照培养基中氟磺胺草醚降解率最高,在pH为5、7和9的反应液中降解速率基本相同,以上结果表明,对照培养基中黄曲霉对氟磺胺草醚的降解速率最快。因此,选择合适的pH对提高降解率有很大意义。

图6 不同pH的培养基对降解作用影响

3 结论

实验确立了真菌黄曲霉在基础培养基中对氟磺胺草醚除草剂最适宜的降解条件：在不调节反应液pH条件下,氟磺胺草醚浓度为10mg/L、温度为25℃、黄曲霉接种量为3%的菌悬母液,培养时间为5d。实验结果表明,该菌株适应一般的环境条件下,即可以对氟磺胺草醚除草剂起到较好的降解作用,为以后人们研究其它菌株对该类除草剂的降解提供了理论依据。

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Research of optimum degradation conditions of fomesafen byAspergillusflavus

CUIWen-juan1,ZOUYue-li1,*,TAOBo2,*,SUNNing1,ZHAODi1,ZHUMei-hua1,ZHANGRu-ru1

(1. College of Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2. College of Agricluture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In this paper,high performance liquid chromatography(HPLC)was used to determine the degradation rate of fomesafen under different conditions. The optimum degradation condition of fomesafen was obtained byAspergillusflavus(TZ1985). The optimum conditions for the fomesafen degradation without adjusting pH condition were found as follows:concentration of fomesafen 10mg/L,inoculum volume of bacteria suspension 3%,temperature 25℃,shaking for 5d and the degradation rate was 92.5%.

fomesafen;Aspergillusflavus;liquid chromatography;degradation conditions

2013-06-25 *通讯联系人

崔文娟(1992-),女,本科,研究方向:除草剂降解及残留检测。

东北农业大学大学生创新创业训练计划资助项目(2013063)；国家自然科学基金项目(30971834)。

TS201.3

：A

：1002-0306(2014)01-0178-04