串联亲和纯化技术筛选Bat3的相互作用蛋白质

吴 为，李琴山，宋 伟，缪时英，王琳芳

中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005

·论 著·

串联亲和纯化技术筛选Bat3的相互作用蛋白质

吴 为，李琴山，宋 伟，缪时英，王琳芳

中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005

目的寻找与Bat3结合的蛋白质。方法采用串联亲和纯化技术，在Bat3编码序列羧基端融合Strep2和FLAG 2个分子标签，以此为诱饵筛选与其特异结合的蛋白质，最后进行质谱鉴定。结果筛选到1种蛋白质分子，命名为Ubl4A，免疫共沉淀结果显示Ubl4A可与Bat3相互结合。结论成功建立了串联亲和纯化技术平台，分离出可与Bat3相互作用的蛋白质Ubl4A。

Bat3;凋亡;串联亲和纯化

材料和方法

材料与试剂Pfu Taq DNA polymerase、限制性内切酶、T4连接酶购自美国NEB公司，DMEM培养基、胎牛血清购自美国GIBCO公司，转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司;Anti-strep2珠子购自德国IKA公司，Anti-Flag珠子购自美国Sigma公司，Biotin、3x-flag多肽购自美国Sigma公司。根据NCBI中Bat3基因序列，利用PRIMER PREMIER软件设计引物：上游为TAAGCTAGCGCCACCATGGAGCCTAATGATAGTACCAG，下游为 AATACGCGTAGGATCATCAGCAAAGGCC。

载体构建及融合蛋白表达的检测以plentilox 3．7慢病毒表达质粒为母体，去掉其U6启动子区，插入带内部核糖体进入位点-增强型绿色荧光蛋白 (internal ribosome entry site-enhanced green fluorescence protein，IRES-EGFP)的巨细胞病毒启动子，将其改造为适合于过表达的慢病毒载体。改造后质粒的多克隆位点 为 EcoR1-Nhe1-Sma1-Mlu1-BamH1，在 Mlu1和BamH1之间插入Strep2-FLAG这两个标签序列，在Nhe1和Mlu1之间插入Bat3表达序列。通过lipofectamine 2000转染Bat3表达质粒，Western blotting检测Strep2和FLAG标签的表达。

包装病毒及感染293T细胞按照10 μg∶10 μg∶10 μg∶20 μg 的剂量，将慢病毒包装辅助质粒 plp1、plp2、VSVG与慢病毒过表达Bat3质粒转染至1个150 mm培养皿的293T细胞内，转染48、72 h后分别收集1次培养上清。将两次收集的上清超速离心，18 000 r/min离心3 h，得到的病毒沉淀用200 μl PBS溶解。分装，冻于-80℃冰箱。按照1∶50的比例将病毒原液加入到培养上清中感染293T细胞，72 h后荧光显微镜观察表达绿色荧光蛋白的细胞的比例。

串联亲和纯化收集5盘150 mm培养皿稳定表达Bat3的细胞，向细胞沉淀中加入5 ml NTEN裂解液，裂解20 min，14 000 r/min离心30 min。向细胞上清加入400 μl anti-Strep2 beads，孵育1 h，NTEN裂解液洗涤beads 3遍，加入1．2 ml含2 mg/ml的生物素洗脱液，洗脱2次。合并洗脱液，加入100 μl anti-FLAG beads，孵育1 h，NTEN裂解液洗涤beads 3遍，加入300 μl含0．2 mg/ml 3x-flag肽段，洗脱 2次，收集洗脱液，超滤浓缩至30 μl体积。

质谱分析将浓缩后的样品进行SDS-PAGE电泳后行考马斯亮蓝染色，切下与对照组有明显差异的条带，送至清华大学生物医学中心做Malti-TOF蛋白质鉴定，得到的肽段序列与NCBI蛋白质数据库对比检索。

免疫共沉淀按照实验设计将带有FLAG标签的Bat3表达质粒和带有Myc标签的Ubl4A表达质粒转染至293T细胞内，48 h后收集细胞，NTEN裂解液裂解细胞，离心后上清液中加入10 μl anti-FLAG beads和10 μl protein-G beads，孵育1 h，用 NTEN洗涤3遍，加入30 μl 1．2×上样缓冲液，制备免疫共沉淀样品。将样品进行SDS-PAGE，用anti-FLAG和anti-Myc抗体进行免疫杂交，检测Bat3与Ubl4A的相互作用。

结 果

慢病毒Bat3表达质粒的构建及鉴定以人293T细胞cDNA为模板，利用所设计的引物扩增人Bat3编码序列，琼脂糖凝胶电泳结果显示，出现大小约为3400 bp的DNA片段。将Bat3片段克隆到改造的plentilox3．7质粒中，转化，PCR鉴定阳性克隆，结果显示扩增出预计的3．4 kb DNA片段 (图1)。进一步测序分析证实Bat3基因序列完全正确。

融合双标签的Bat3表达通过lipofectamine 2000将构建好的Bat3慢病毒表达质粒转染入293T细胞，48 h后行Western blot检测Bat3融合标签的表达情况，结果显示用anti-FLAG与anti-Strep2一抗孵育后，发现在相对分子质量130 000～170 000之间有1个目的条带，与预期的相对分子质量相符 (图2)。

建立稳定表达Bat3的293T细胞系病毒感染293T细胞72 h后，荧光显微镜可观察到绿色荧光的

表达，表达绿色荧光的细胞约为100%(图3)。

图1 PCR扩增Bat3蛋白编码序列及PCR鉴定plenti-Bat3重组质粒Fig 1 PCR amplification of Bat3 protein coding sequence and PCR identification of recombinant plenty-Bat3 plasmids

图2 Western blot检测重组慢病毒plenti-Bat3融合标签FLAG和Strep2的表达Fig 2 Identification of expression of the fused FLAG and Strep2 tag by Western blot analysis

图3 慢病毒感染后293T细胞发绿色荧光Fig 3 293T cells displaying green fluorescence after lentivirus infection

Bat3相互作用蛋白质的分离及鉴定收集5个150 mm培养皿的表达Bat3的293T细胞，分别用anti-Strep2 beads和anti-FLAG beads亲和纯化两次，将所得的样品进行SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色，结果显示，与对照组相比，Bat3组有明显差异的条带。将其中箭头所指的差异条带切胶送去清华质谱中心鉴定，所得的肽段序列与NCBI蛋白数据库比对，显示鉴定的蛋白质为Ubl4A(图4)。

免疫共沉淀验证Bat3与Ubl4A相互作用按照实验设计将表达FLAG标签的Bat3质粒和表达Myc标签的Ubl4A质粒转染293T细胞，48 h后加入FLAG beads，制备免疫共沉淀样品。Western blot检测其中FLAG和Myc的表达，结果显示，Bat3与Ubl4A共转组中可检测到Myc表达，而在Bat3和Ubl4A单独转染组中没有检测到Myc表达 (图5)。

图4 串联亲和纯化后的电泳图Fig 4 SDS-PAGE analysis of TAP products

图5 免疫共沉淀检测Bat3与Ubl4A相互作用Fig 5 Co-immunoprecipitaion detects the interaction between Bat3 and Ubl4A

讨 论

本研究首先在保证读码框正确的前提下，将Bat3蛋白质编码序列与串联的Strep2和FLAG标签序列融合，然后将融合了串联标签的Bat3基因导入到改造的慢病毒表达载体上，通过293T细胞包装产生有活性的慢病毒，以293T细胞为感染对象，获得稳定表达融合双标签Bat3基因的293T细胞系。随后在温和的裂解条件下，经过Strep2 beads和FLAG beads两次亲和纯化，进行SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色，得到了与对照组相比清晰的差别条带，经质谱鉴定为Ubl4A分子，最后经免疫共沉淀实验也证实了这种蛋白质-蛋白质相互作用。研究表明，Ubl4A可与Bat3、TRC40形成蛋白质复合物，在尾部锚定膜蛋白的成熟与降解之间发挥关键性作用［6-8］。

与常规的免疫亲和纯化相比，串联亲和纯化通过两步纯化步骤，富集了差异条带，降低了样品中的非特异蛋白质背景，同时由于整个纯化过程都处于类似生理条件下，能够很好的模拟体内状态下的蛋白质相互作用。然而在本研究中，TAP这套系统还是有一些不足。为了获得更加接近于体内的结果，靶蛋白的表达量应该维持或接近于体内正常生理表达水平［9］。Bat3是一个核质穿梭蛋白，在不同生理条件下，Bat3的定位不同。本研究中采用巨细胞病毒启动子驱动Bat3的过表达，CMV是一个十分强大的启动子，促使Bat3蛋白质表达量远远高于体内自然水平。这样，一方面会引起非特异性的蛋白质相互作用，另一方面改变了Bat3的定位，促进了非生理条件下蛋白质相互作用的产生。此外，由于蛋白质之间的相互作用亲和力有强有弱，TAP经过多次漂洗过程，其中亲和力较弱的蛋白质相互作用易在漂洗过程中丢失，不易被扑捉到［10］。为了改进这些问题，本课题组正在尝试腺相关病毒介导的同源重组技术，将Strep2和FLAG双标签导入到细胞的Bat3基因组中，这样就能真正模拟体内的生理条件。同时将细胞用DSS等偶联剂处理，将微弱的蛋白质相互作用固定，大大增加扑捉较弱的相互作用的机会。总之，通过不断的改进，串联亲和纯化技术是一项极具潜力的分离相互作用蛋白质的工具。

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Identification of Proteins Interacted with Bat3 Using Tandem Affinity Purification

WU Wei，LI Qin-shan，SONG Wei，MIAO Shi-ying，WANG Lin-fang

National Laboratory of Medical Molecular Biology，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS and PUMC，Beijing 100005，China

WANG Lin-fang Tel：010-69156418，E-mail：wang．linfang@imicams．ac．cn

ObjectiveTo identify the specific protein interactions involved in Bat3-mediated apoptosis．MethodsTandem affinity purification(TAP)was utilized to investigate Bat3-protein interactions，during which full-length human Bat3 fused with Strep2 and FLAG tag as a bait was used to screen the specific proteinprotein interactions．The isolated proteins were identified with mass spectrometry．ResultsTAP studies showed that Ubl4A was identified as a Bat3-binding partner．Further investigation using co-immunoprecipitation confirmed that Bat3 was associated with Ubl4A．ConclusionTAP was successfully established and is suitable for isolating the binding partners of Bat3．

Bat3;apoptosis;tandem affinity purification

王琳芳 电话：010-69156418，电子邮件：wang．linfang@imicams．ac．cn

Q-31

A

1000-503X(2014)01-0001-04

10．3881/j．issn．1000-503X．2014．01．001

Acta Acad Med Sin，2014，36(1)：1-4

细胞凋亡也称为程序性细胞死亡，在维持机体发育及自身稳态方面可发挥重要作用。细胞凋亡是一个多基因严格调控、高度有序的过程，一旦失控可导致恶性肿瘤、神经退行性病变、自身免疫性疾病等相关疾病。Bat3又名Bag6/Scythe，在细胞凋亡的调控中发挥重要作用［1］。Bat3基因敲除小鼠在胚胎期就已死亡，肺、肝、肾、睾丸等组织明显发育不良，组织切片显示细胞凋亡比例明显增加［2］。目前研究表明，Bat3主要通过与其他蛋白质结合而发挥作用，例如，其可与淀粉前体蛋白样蛋白-2(amyloid precursor-like protein 2，APLP2)相互作用，增加APLP2的表达而拮抗细胞凋亡［3］。然而，由于基因在不同的发育器官、不同的发育阶段存在表达特异性，因此寻找Bat3不同的相互作用蛋白对于深入了解Bat3的生理病理功能具有十分重要的意义。串联亲和纯化是由Rigaut等［4］于1999年建立的，他们通过表达融合两种不同亲和标签分子的靶蛋白，经过两步亲和层析，分离纯化与靶蛋白特异结合的相互作用蛋白质。其优点在于可以模拟体内生理条件，高效、特异地分离蛋白质聚合物。与传统的亲和纯化技术相比，该技术筛选到的相互作用蛋白假阳性率较低，大大降低了后续工作的难度［5］。本研究通过构建串联亲和纯化这个技术平台并结合质谱鉴定技术，分离得到了与Bat3结合的蛋白质，以期为阐述Bat3的生理功能及作用机制提供理论基础。

国家重大研究计划项目 (2011CB944302)和国家重点实验室专项基金 (2060204)Supported by the National Important Research Plan of China(2011CB944302)and the State Key Laboratory Special Fund of China(2060204)

2013-05-17)