Simul5软件在毛细管电泳柱上富集模拟中的应用*

2014-09-18张红医王子川刘伟石志红单金缓

大学化学 2014年5期

张红医王子川刘伟石志红单金缓

(河北大学化学与环境科学学院河北保定071002)

由于毛细管电泳分析方法具有样品用量少、试剂用量少、分析时间短等优点，已经成为分离科学家族中的一个重要工具［1］。目前已有多种用于毛细管电泳的检测器，如激光诱导荧光、质谱、电化学检测器等，但大多数商品毛细管电泳仪标配的检测器仍为柱上UV检测器。如果将毛细管内径近似作为光程长度，则可从朗伯比尔定律推知，这种检测方法的最低检测浓度较高，对于低浓度的样品难以给出令人满意的检测信号。为了解决这一问题，很多柱上富集技术应运而生［2］。在数学模型基础上发展起来的动态模拟软件不仅可以帮助人们快速地优化分离富集条件，而且可以使人直观地看到每一时刻富集的微观变化过程;更重要的是在实施过程中，操作者完全不需要掌握复杂的数学计算。目前应用较为广泛的模拟软件是Simul5［3］和Gentrans［4］，它们的应用在国外重要期刊已有报道［5-7］，但在中文文献中却鲜有述及。

目前，一些高校已在大学本科实验教学中开设了有关毛细管电泳的实验［8-11］，为了进一步推动毛细管电泳在大学本科实验教学中的应用，本文介绍了Simul5软件的使用方法，并通过实例模拟了瞬时等速毛细管电泳对模型离子的富集。

1 Simul5的安装与使用

1.1 Simul5的下载与安装

Simul5是由Gaš研究组［3］开发的动态毛细管电泳模拟软件。该软件可从http://www.natur.cuni.cz/gas免费下载。下载的压缩包中不仅包含Simul5的使用手册和一些实例文件，更重要的是含有扩展名为exe的文件。Simul5软件不需要安装，直接点击exe文件即可在Windows平台上运行该软件。该软件由在逻辑上和功能上密不可分的3个视窗组成，这3个视窗的名称分别为Simul5(图1)、Addconstituent(图2)和Runsetup(图3)。下面依次介绍这3个视窗。

1.2 Simul5的主视窗

Simul5视窗为软件的主界面，可粗分为上下两个区域。上半部分为设置显示部分。在模拟过程中，不仅需要电泳分离实验的仪器参数(如电泳分离所使用的电压、运行过程中流经毛细管柱的电流、电渗流大小等)，还需要电泳分离过程中的物质参数(如背景电解质溶液组成、pH以及分析物的pKa等基本信息)。除此之外，为了完成动态模拟过程，还需要设定一些模拟参数。依据所承担实验功能的不同，可将设置显示区自左至右进一步分为3个区:仪器运行参数显示区、物质组成区以及模拟控制区(图1)。下半部分为动态模拟状态显示区。

图1 Simul5主界面

1.3 AddConstituent视窗

分析物及背景电解质成分的淌度u和离解常数pKa等是模拟优化所必需的基本物理化学常数，这些数据需要用户根据实际情况从软件自备数据库中选用。选择后，在Simul5主界面区右上部的“物质组成区”处将显示具体数值信息。

图2 物质添加窗口

点击位于Simul5视窗右上部的“组分区”中的“Add”按钮，就可打开AddConstituent视窗(图2)。如果要使用20mmol/L的醋酸作为电泳分析的背景电解质溶液，可以在位于此窗口下面的“Databaseof constituents”栏中找到“ACETICACID”(醋酸的英文名称)。在其同行右侧部分，可以依次看到与该物质对应的负电荷数n，正电荷数p，离解常数pKa和极限淌度值u。双击此行，该物质的英文名称ACETIC ACID将显示在“Name”下的空白处，而其对应的电荷、pKa和u等信息将显示在窗口右上侧的空白区。然后，在“Concentration”下空白处键入20(注:在软件界面显示的单位为“mM”，而按法定计量单位应显示为“mmol/L”)，在“Type”选项中选择 BGE(BackgroundElectrolyte背景电解质的缩写)，在“C(Injection)”中键入20，最后点击位于右下角的“Accept”按钮，完成物质信息的添加过程。

由于软件自备数据库的容量有限，如果作为分析物或者背景电解质成分的化合物还没有被收集到此数据库中，就需要从手册或文献中查到其相关信息并补充进数据库。数据库中任何一个合法的物质必须具备完备的信息(名称、正电荷数p、负电荷数n、酸度常数pKa和有效淌度u等信息缺一不可)。要进行数据库的扩充，需选择在Simul5主界面视窗左上部的功能栏Tools中的“AmphlinesWizard”选项，点击此选项会弹出一个对话框，先输入要创建的物质数目，再点击OK键，然后在再次弹出的对话框中输入创建物质的名称，点击OK，然后再次分别输入该物质的最小负电荷和最大正电荷以及相应的解离常数(pKa)和淌度值(u)，最后输入该物质的浓度，单击Yes，完成添加。至此，该化合物的基本信息就已添加到数据库中。

1.4 RunSetup视窗

单击位于Simul5主界面上方偏左的“RunSetup”按钮，可开启RunSetup(图3)视窗。该视窗分为6个模块，分别为“InitialConditionsandDetectorPosition”、“EnvironmentandCapillarySetup”、“Walls(BordersofCalculatedSpace)”、“InitiatePositionofWalls”、“WallRefreshRate(Steps)”、“PSQSave”和“PowerMode”。

图3 运行设置窗口

“InitialConditionsandDetectorPosition”模块承担着设定初始条件和检测器位置的任务，包含着几个重要的模拟参数。“InjectionSite(mm)”负责样品注射位置的设定，其值为毛细管柱中样品初始带宽的一半。“DetectorPosition(mm)”负责检测器位置的设定。当图1“模拟控制区”中的“Enabledetector”的选项被勾选，在主界面的“运行状态区”的浅色竖线就代表着检测器的位置。如果勾选了位于Simul5主界面的“行状态区”的“EOFbydetector”，程序将按照已在主界面“EOFMobility(1E-9)”设定的电渗流大小来连续移动检测器实现对电渗流的模拟。为了节省模拟节点数，检测器可以放到模拟范围外，因而只有当检测器到达模拟区域后才能进行数据采集。点击Simul5主视窗上的“Sim/Det”可以观察到检测信号。“CapillaryLength”用于设定毛细管的模拟长度。将毛细管的模拟长度与“AdditionalLength(Run Setup)”(附加长度)结合在一起才能计算出运行过程中的实际电流大小。当使用“AddConstituent”视窗中“AdvancedSetup”时，也会用到毛细管模拟长度。“PeakWidth”负责注射带宽度的设定。“Peak EdgeWidth”是各种注射带初始平滑衔接的量度，决定着初始的浓度分布、淌度和pKa轮廓。“Mesh Density(Nodes)”表示模拟空间的独立分组(注意:使用的节点数要比MeshDensity值大1)。这个值越大，陡峭边界的数字摆动就越小，但模拟时间随之变长。通过降低电压或者电流(Simul5主窗口)也可以平滑边界。

“EnvironmentandCapillarySetup”模块主要包括更新速率和dt优化参数的设定。“Temperature”的设定用于由淌度值计算扩散系数。“CapillaryDiameter”的设定用于由电流密度来计算流经毛细管的电流大小。“EditsRefreshRate”是主窗口中可编辑值(时间，误差等)的更新频率。“GraphRefreshRate”是图形更新频率。“DetectorInput”是检测器数据采集频率。如果数据采集量过大，其他操作(如打开、保存等)可能会变慢。实际项目中的数据采集量可以通过位于主菜单Tools中“Tools/Detector”里的“DetectorDataTool”进行减半处理。“OptimizationInterval”是dt优化频率(需预先在主窗口中选用“Optimisedt”)。由于dt变化时，误差值的稳定需要一定的时间，所以这个值不能过高。“dtOptimizationIncrement”的默认值为0.25。

对于普通用户来讲，一般只需对“InitialConditionsandDetectorPosition”模块和“Environmentand CapillarySetup”模块中的内容进行选择，包括注射位置、检测器位置、毛细管的模拟长度、峰宽、实验温度、毛细管内径及电源模式(恒电压或者恒电流)等，除此之外的其他参数均可用默认值。

1.5 模拟与结果输出

在完成上述3个视窗中参数的设定后，依次点击位于Simul5主界面上的初始化按钮“Init”与模拟运行按钮“Run”，模拟运行即开始。

当模拟实验物质通过检测器后，单击运行控制栏的“Stop”按钮可结束模拟。然后单击主界面中的“Save”按钮，在弹出的对话框中选择保存的路径并输入保存文件的名称，文件将以sna格式保存。

模拟数据的导出是先点击菜单栏中“Tools”下拉菜单里的“ExportAlltoCsv”选项，在弹出的“Export All”对话框中输入导出文件夹的名称，再点击“OK”即可。导出的文件夹会默认保存在名为ExportProfiles的文件夹中，导出的Excel文件分为两大类:一类是以det开头的，表示的是模拟峰形通过检测器的数据;另一类是以sim开头的，表示的是模拟峰形在毛细管中的数据。可以在解压文件中打开Export Profiles文档，从中找到此前保存的文件，文件中所有数据以csv格式保存，可以利用Excel程序将其打开，并利用其他作图软件作图。

1.6 模拟参数设置的要点

模拟参数的设定不仅会影响模拟时间的长短，而且也与模拟结果的正确性相关。不正确的参数设定可造成模拟图形产生较大的波动，甚至在模拟过程中弹出错误窗口。

在模拟实验中，应尽量选择较小的电压或电流，也可以增加“GridPoints”的数值(数值范围为500～50000);合理设置“SetMaxError”的数值对动态模拟图的影响也很重要，如果想提高模拟速度，可以将此值调得大一些。当不了解模拟的具体情况时，可以选择Optimizedt选项，系统会以最优时间进行模拟。若需要提高模拟速度，可以增大dt或增大SetMaxError的数值。

在模拟实验与实际实验相对比时，有如下的设置规则，定义L0=10L1且V0=100V1(L0为实验的柱长;L1为模拟实验的柱长。单位均为mm。V0为实验的电压，单位为kV;V1为模拟电压，单位为V)。运用此规则进行模拟实验时，模拟峰形与实验峰形相比会略有些展宽。如果所有模拟参数值的设置与实验设定值相一致，可避免峰展宽的效应，但是会加大计算机的工作量，显著增加模拟时间。

2 Simul5模拟区带电泳与瞬时等速电泳过程

毛细管电泳具有多种操作模式，主要有区带电泳、胶束电动色谱、等电聚焦等，其中毛细管区带电泳是最常用的分离模式。一般检测手段为柱上紫外检测，由于短光程会导致检测灵敏度不高，为解决这一问题，可将柱上瞬时等速电泳与区带电泳相结合。为此，以Simul5模拟了瞬时等速电泳，并观察了不同阶段的富集变化。

2.1 模拟条件与参数设置

富集模型离子的物理参数为pKa-1.37与淌度值30×10-5cm2·V-1·s-1。作为分离电解质组分的三羟甲基氨基甲烷(Tris)的有效淌度值与pKa分别为29.5×10-5cm2·V-1·s-1和8.076;作为前导离子及背景电解质组分的氯离子的有效淌度值与pKa分别为79.1×10-5cm2·V-1·s-1和-2.7;氢氧化钠的有效淌度值与pKa分别为51.9×10-5cm2·V-1·s-1和13.7;作为尾随电解质的MES(吗啉乙磺酸)的有效淌度值与pKa分别为28×10-5cm2·V-1·s-1和6.095。

为了节省模拟时间，设定模拟毛细管柱长为8mm。检测器的位置为8mm，进样端位置为2mm，峰宽为2mm，峰的边缘宽度为0.1mm，格点数为2000，模拟温度为25℃，毛细管内径为75μm，恒压-200V，其余的参数设置维持默认值。

2.2 模拟分析

图4为区带电泳的模拟图。分析对象为一阴离子，其 pKa为 -1.37，淌度值为30×10-5cm2·V-1·s-1。从图4可以明显看出，由于进样体积较大，由初始状态0s运行至1.7s，没有富集效果，样品区带存在明显的展宽现象。当样品初始浓度保持0.1mmol·L-1和进样时间不变的前提下，以氯离子为前导离子，以MES为尾随电解质，可实现模型离子的柱上富集(图5)。由图5可见，在0～3s的富集过程中，模型离子的带宽明显减少，模型离子的高度逐渐增加(从0.1mmol·L-1增加到8.2 mmol·L-1)，可达到82倍的富集效果。