大豆黄酮对人肝癌SMMC7721细胞增殖及肿瘤干细胞CD133表达的影响

张敏，孙宏治，王巍，白光，于晓东

（1.辽宁医学院附属第一医院 肝胆外科，辽宁 锦州 121001；2.辽宁医学院附属第一医院 普外科，辽宁 锦州 121001）

大豆黄酮对人肝癌SMMC7721细胞增殖及肿瘤干细胞CD133表达的影响

张敏1，孙宏治2Δ，王巍1，白光1，于晓东1

（1.辽宁医学院附属第一医院 肝胆外科，辽宁 锦州 121001；2.辽宁医学院附属第一医院 普外科，辽宁 锦州 121001）

目的探讨大豆黄酮对人肝癌SMMC7721细胞增殖及肿瘤干细胞CD133表达的影响。方法将肝癌SMMC7721细胞分成6组：阴性对照组不加药；根据添加大豆黄酮浓度的不同，分成 100μg／mL组、200μg／mL组、300μg／mL组、400μg／mL组、500μg／mL组，培养24 h、48 h、72 h后MTT法检测细胞的抑制率、测定每组细胞中己糖激酶和碱性磷酸酶活性和CD133表达水平并进行比较。结果大豆黄酮浓度越高，对肝癌细胞的抑制作用越强；随着处理时间的延长，抑制作用有所下降；尤其在400μg／mL浓度组和500μg／mL浓度组，时间效应更明显。与对照组相比，经不同浓度大豆黄酮处理的肝癌细胞己糖激酶活性和碱性磷酸酶活性均显著降低（P＜0.01），肿瘤干细胞CD133表达明显下降（P＜0.01），并且浓度越高下降幅度越大。结论大豆黄酮能够抑制肝癌SMMC7721细胞的增殖，并降低肿瘤干细胞CD133的表达。

大豆黄酮；肝癌SMMC7721细胞；CD133

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 试验细胞为人肝癌细胞株SMMC7721细胞系（由中美合资博慧斯生物医药科技有限公司提供）。大豆黄酮为本实验室制备。MTT、胰蛋白酶由Sigma公司提供，CD133兔抗人单克隆抗体（上海领成生物科技有限公司），己糖激酶试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司），碱性磷酸酶试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）。培养器皿（北京冬璞泰和科技有限责任公司）。电泳仪（北京六一仪器厂，型号WD-9408C）。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养肝癌SMMC7721细胞37℃水浴解冻，然后将细胞制成混悬液离心，500 r／min，离心3min，保留沉淀。细胞进行培养、消化、传代，细胞生长到对数生长期，将细胞制成单细胞悬液，调整浓度为10×104个／mL。将混悬液移入96孔板，进行培养。

1.2.2 药物处理 显微镜下可见细胞铺满孔板底时进行分组加药处理。根据加入大豆黄酮浓度的不同分为100μg／mL组、200μg／m L组、300μg／mL组、400μg／mL组、500μg／mL组，阴性对照组不处理。

1.3 观察指标 药物分别作用24 h、48 h、72 h后进行相关指标检测。采用MTT法测定细胞成活率，抑制率＝（阴性对照组OD值-加药组OD值）／阴性对照组OD值×100%。按照己糖激酶试剂盒的操作说明测定己糖激酶活性，按照碱性磷酸酶试剂盒操作流程测定碱性磷酸酶活性。采用Western blot分析不同药物浓度作用后肝癌细胞CD133蛋白表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS15.0进行数据处理，正态计量资料采用“x±s”表示，采用F检验或t检验。相关性分析采用线性相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同大豆黄酮浓度、作用时间对肝癌细胞的抑制作用

大豆黄酮浓度越高，对肝癌细胞的抑制作用越强（P＜0.01），并且随着作用时间的延长，抑制作用有所下降，尤其400μg／mL浓度组和500μg／mL浓度组，时间效应更明显（P＜0.01，见表1）。

表1 不同大豆黄酮浓度对肝癌细胞的抑制作用Tab.1 Inhibition of Daidzein on hepatocellular carcinoma SMMC7721 cell

2.2 不同大豆黄酮浓度、作用时间对肝癌细胞己糖激酶活性的影响 经不同大豆黄酮作用的肝癌细胞己糖激酶活性与对照组比较显著下降（P＜0.01）。大豆黄酮浓度越高，己糖激酶活性越低，但是时间依赖性不明显（见表2）。

表2 不同大豆黄酮浓度、作用时间对己糖激酶活性的影响Tab.2 Effect of Daidzein on Hexokinase activity

2.3 不同大豆黄酮浓度、作用时间对肝癌细胞碱性磷酸酶活性的影响 经不同浓度大豆黄酮作用的肝癌细胞碱性磷酸酶活性与对照组比较均显著下降（P＜0.01）。大豆黄酮浓度越高，碱性磷酸酶活性越低，但是时间依赖性不明显（见表3）。

表3 不同大豆黄酮浓度、作用时间对碱性磷酸酶活性的影响Tab.3 Effect of Daidzein on alkaline phosphatase activity

2.4 不同大豆黄酮浓度作用肝癌细胞后对CD133表达的影响 与对照组比较，经过不同大豆黄酮作用的肝癌细胞CD133表达均显著下降（P＜0.01），并且浓度越高下降幅度越大（见表4，图1）。

表4 不同大豆黄酮浓度作用肝癌细胞后对CD133表达的影响Tab.4 Effect of Daidzein on CD133 expression

图1 不同大豆黄酮浓度处理后肝癌细胞CD133表达情况1.对照组；2.大豆黄酮100μg／mL组；3.大豆黄酮200μg／mL组；4.大豆黄酮300μg／mL组；5.大豆黄酮400μg／mL组；6.大豆黄酮500μg／mL组Fig.1 CD133 expression in hepatoma cells after different concentrations of daidzein1.control group；2.100μg／mL daidzein group；3.200μg／mL daidzein group；4.300μg／mL daidzein group；5.400μg／mLμg／mL daidzein group；6.500μg／mL daidzein group

3 讨论

肝癌恶性程度高、进展快、疗效差、预后差、病死率高。目前肝癌的治疗主要是手术治疗、化疗、放疗、生物治疗等，但总体上治疗效果欠佳。肝癌早期可无任何征兆，而确诊时往往已经丧失了最佳的治疗时机，不适合手术治疗，只能采用保守治疗［3-4］。肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞［5-6］。肿瘤细胞生长、转移和复发的特点与干细胞的基本特性十分相似，因此，肿瘤干细胞（tumor stem cell，TSC）理论的提出为我们重新认识肿瘤的起源和本质，以及临床肿瘤治疗等提供了新的方向和角度。肿瘤干细胞对肿瘤的存活、增殖、转移及复发有着重要作用［7-9］。肿瘤干细胞可以长时间处于休眠状态并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感，因此肿瘤往往在常规肿瘤治疗方法消灭大部分普通肿瘤细胞后一段时间复发［10］。CD133是一种跨膜蛋白，是目前使用最多的肿瘤干细胞标记物，用于肿瘤干细胞的鉴别［11］。大豆黄酮是黄酮类化合物中的一种，主要存在于豆科植物中，其代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性，是天然的癌症化学预防剂。具有预防乳腺癌、前列腺癌、心脏病、疏松症、心血管疾病等作用，可用于防治乳腺、子宫内膜、结肠、前列腺、肺、皮肤等癌细胞的生长和白血病等［12］。

葡萄糖是机体重要的能量来源，在葡萄糖的利用中，磷酸化是其分解的第一步，而己糖激酶是催化葡萄糖发生磷酸化的催化酶，此过程单向不可逆。因此己糖激酶的活性决定着糖类代谢的快慢，也影响到细胞对糖类的代谢使用［13］。在本次研究中，大豆黄酮能够显著抑制肝癌细胞的己糖激酶活性，并且随着浓度的升高，抑制作用越明显。但是不同时间点，其抑制作用并没有显著差异，说明其对己糖激酶活性的抑制作用具有浓度依赖性，但没有时间依赖性。

碱性磷酸酶属于同源二聚体蛋白，分子量为56Kda，广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。与激酶的作用正相反，通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等［14-15］。碱性磷酸酶和肝细胞的代谢状况具有密切的相关性。因此通过检测碱性磷酸酶的活性能够间接反映肝癌细胞的活性。在本次研究中，大豆黄酮对肝癌细胞的碱性磷酸酶活性具有一定的抑制作用，并且随着浓度的升高，其抑制作用也越来越强。但是其时间以来作用并不明显。

通过分析不同浓度大豆黄酮作用过的肝癌细胞CD133的表达，分析大豆黄酮对肿瘤干细胞CD133表达的影响，结果显示，随着浓度的升高，肿瘤干细胞CD133蛋白表达显著下降，提示有可能大豆黄酮对肿瘤干细胞具有抑制作用，但是也不排除是肿瘤干细胞分化成了其他细胞，或者只是抑制了CD133的表达。对大豆黄酮作用过的肝癌细胞进行计数，结果显示，不同浓度，其对肝癌细胞的抑制作用不同，浓度越高，抑制作用越强，说明其对肝癌细胞的抑制作用具有浓度依赖性。但是在400μg／mL和500μg／mL两个浓度，24 h的抑制率显著高于48 h和72 h的抑制率，具体机制还需要进一步研究分析。

综上所述，大豆黄酮能够抑制人肝癌SMMC7721细胞的增殖，可能是通过抑制己糖激酶从而减少了肿瘤细胞对糖类能量的摄入。大豆黄酮作用后肝癌细胞虽然CD133表达下降，但其对肿瘤干细胞是否具有抑制作用，还需要选择更可靠的肿瘤干细胞标记物做进一步的研究。

［1］肖斌，李燕茹，蒋段林，等.舌鳞癌组织中肿瘤干细胞的分离培养及 PIWIL4对其的影响［J］.中国医药指南，2013，11（33）：299-300，305.

［2］陈砚凝，王建新，倪晓晨，等.消化系统肿瘤中ABCG2阳性肿瘤干细胞表达与肿瘤生物学行为的关系［J］.河北医科大学学报，2013，54（12）：1610-1612.

［3］彭朝阳.手术治疗50例原发性肝癌患者临床疗效观察［J］.中国现代药物应用，2014，8（4）：73-74.

［4］周燕华，徐子海，廖福锡，等.原发性肝癌分次伽玛刀治疗后血清AFP降低程度与复发转移相关性的临床研究［J］.广西医科大学学报，2013，30（6）：908-909.

［5］何涛，李国庆，谢娟，等.miR-145对HepG2细胞中肿瘤干细胞增殖的影响［J］.中国医药指南，2013，11（31）：62-63.

［6］许扬梅，龚福生，陈雪芳，等.胃癌细胞系SGC-7901肿瘤干细胞样细胞的分离和鉴定［J］.福建医科大学学报，2013，47（4）：223-227.

［7］涂艳阳，高兴春，李刚，等.MicroRNA.218通过靶向多梳家族Bmil基因抑制胶质瘤的侵袭、迁移、增殖和肿瘤干细胞样细胞的自我更新［J］.转化医学电子杂志，2014，1（1）：4-13.

［8］梁洪享，钟竑，罗勇，等.肿瘤干细胞标记物 CD133、CD4A、SOX2、OCT4、ALDH1在NSCLC中的表达及临床意义［J］.实用癌症杂志，2013，28（5）：472-475.

［9］Reya T，Morrison SJ，Clarke MF，et al.Stem cells，cancer，and cancer stem cells［J］.Nature，2001，414（6859）：105-111.

［10］谢建伟，黄昌明，郑朝辉，等.肿瘤干细胞表面标记物CD44在胃癌中的表达及其意义［J］.中华胃肠外科杂志，2013，16（11）：1107-1112.

［11］梁洪享，钟弦，罗勇，等.肿瘤干细胞标志物 CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义［J］.肿瘤防治研究，2013，40（12）：1138-1142.

［12］才金玲，单群，陆军，等.大豆黄酮对衰老小鼠脑组织神经递质含量的调节［J］.天津科技大学学报，2011，26（6）：16-19.

［13］朱智勇，马颖才，唐莉，等.缺氧对食管鳞状细胞癌中缺氧诱导因子-1α和己糖激酶-Ⅱ表达的影响［J］.中国老年学杂志，2013，33（15）：3697-3698.

［14］杨沛，邓少丽，陈伟，等.5’-核苷酸酶的测定及临床意义［J］.现代医药卫生，2013，29（24）：3754-3755.

［15］Chiranjit M，Atanu A，Kuntal G，et al.Hypobaric-hypoxia Induces Alteration in Microbes and Microbes-associated Enzyme Profile in Rat Colonic Samples［J］.Biomedical and Environmental Sciences，2013，26（10）：869-873.

（编校：吴茜）

Effect of daidzein on hepatocellular carcinoma SMMC7721 cell proliferation and tumor stem cell CD133 expression

ZHANGMin1，SUN Hong-zhi2Δ，WANGWei1，BAIGuang1，YU Xiao-dong1

（1.Department of Hepatobiliary Surgery，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China；2.Department of General Surgery，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College Medical College，Jinzhou 121001，China）

ObjectiveTo discuss the effect of daidzein on hepatocellular carcinoma SMMC7721 cell proliferation CD133 expression on tumor stem cell.MethodsHepatocellular carcinoma SMMC7721 cellswere cultured，digested and passaged，and divided into six groupswith different drug：control group with no daidzein，100μg／mL daidzein group，200μg／mL daidzein group，300μg／mL daidzein group，400μg／mL daidzein group，500μg／mL daidzein.The inhibition ratio，hexokinase，alkaline phosphatase and CD133 levels in SMMC7721 cellwere detected and compared at24 h，48 h，72 h among those groups.ResultsThe inhibition ratiowas increased by Daidzein dose increasing，and decreased apparently by timesextending，especially in 400μg／mL and 500μg／mL daidzeingroups.Compared with control group，the hexokinase and alkaline phosphatase activity and CD133 expression were decreased apparently in groups treated with daidzein（P＜0.01）.Themore the dose，the higher the drop（P＜0.01）.ConclusionDaidzein can inhibit hepatocellular carcinoma SMMC7721 cell proliferation，and inhibit CD133 expression on tumor stem cell.

daidzein；hepatocellular carcinoma SMMC7721 cell；CD133

735.7

A

1005-1678（2014）03-0028-03

原发性肝癌多起病隐匿，发展迅速，患者预后差，死亡率占消化系统恶性肿瘤的第3位。CD133是肿瘤干细胞表面的肿瘤标记物之一，肿瘤干细胞与细胞的发生发展、转移、耐药性等均具有密切的关系［1-2］。己糖激酶在糖代谢中发挥重要作用，其和碱性磷酸酶可反映细胞的代谢能力。研究显示大豆黄酮能够抑制肝细胞的增殖。本研究旨在探究大豆黄酮对肝癌细胞己糖激酶和碱性磷酸酶的影响，分析其对肝癌细胞增殖的影响和肝癌干细胞CD133表达的影响。

吴阶平基金（320.6750.1393）

张敏，女，本 科，中级，研究方 向：肝胆外 科，E-mail：xiyuess011121＠sina.com；孙宏治，通信作者，男，博士，教授、主任医师，研究方向：普外科，E-mail：cmushz＠163.com。