猪支原体肺炎双抗体夹心ELISA方法的建立

毛春玲 陈欣 王静 秦立鑫/哈药集团生物疫苗有限公司

猪支原体肺炎双抗体夹心ELISA方法的建立

毛春玲 陈欣 王静 秦立鑫/哈药集团生物疫苗有限公司

猪肺炎支原体（MPS）是由猪支原体肺炎（Mhp）引起的猪地方流行性肺炎，该病是一种接触性慢性呼吸道传染病。猪只感染后会降低饲料转化率，影响生长发育，并引起其他病毒及细菌的继发感染。该病流行于世界各地，对养猪产业造成了严重的经济损失。（1）由猪肺炎支原体所引起的猪气喘病普遍存在于养殖业发达的国家，该病一直以来是困扰我国养殖业发展的重要疾病。据统计，2010年我国生猪出栏近6亿头，90%以上养殖基地和规模化养猪场都存在着感染猪肺炎支原体的风险，国内该病的感染率可高达80%，是造成我国养猪业经济损失的猪重要传染病之一。

由于本病同其他引起猪呼吸道的疾病表现出极为相似的临床症状, 并可与猪蓝耳病病毒（Prrs）、猪圆环病毒2型（PCV2）,胸膜肺炎放线杆菌（APP）等混合感染，并伴随混合感染和继发感染, 增加了临床诊断的难度。目前MhPs的诊断方法主要有：病原分离培养，间接血凝抑制（IHA）、补体结合试验（CFT）、 PCR、环介导等温扩增技术(LAMP）等方法(4）。病毒分离耗时长：PCR、IHA、CFT、LAMP等方法对操作条件及人员有很高的要求，并且费用较高，均不适合在现地推广。

针对现地中检测Mhp的情况，我们开展了建立双抗体夹心ELISA检测Mhp的研究，以抗Mhp的兔多抗为捕获抗体，抗MhPs的单克隆抗体3D6为检测抗体，建立了具备较好的敏感性、特异性及重复性的双抗体夹心ELISA方法。

一、材料与实验方法

1.抗体制备。抗Mhp的单抗3D6及抗Mhp的兔多抗由哈药集团生物疫苗有限公司保存。

将保存的单抗3D6及抗Mhp的兔多抗分别用GE公司的ProteinG 和ProteinA试剂盒进行抗体纯化，并用BCA Protein Assay kit对抗体浓度进行测定。按照测定结果，将单抗3D6用PBS的浓度调节为3ug/ml,用pH9.6的碳酸盐溶液调节抗MhPS的兔多抗的浓度为5ug/ml。

2.双抗体夹心ELISA实验方法。

（1）将用pH9.6的碳酸盐溶液稀释后的抗MhP兔多抗包被，每孔加入100μl, 置4℃过夜，弃去孔中液体。

（2）含0.5%Tween-20的PBS溶液洗板3次，每次3 min。

（3）加入待检测样品和不含病毒的空白对照，37℃孵育1h。

（4）弃去孔中液体 ，用含0.5%Tween-20的PBS溶液洗板3次，每次3 min。

（5）加入调节好浓度的抗PRRSV的N蛋白的单抗3D6加入孔中，3 ug/ml，每孔100 ul，37℃孵育1 h。

（6）弃去孔中液体，用含0.5%Tween-20的PBS溶液洗板3次，每次3 min。

(7） 加入酶标抗鼠抗体，37℃孵育40 min。

（8）弃去孔中液体 ，用含0.5%Tween-20的PBS溶液洗板3次，每次3 min。

（9）加入TMB(四甲基联苯胺）显色液，每孔100 ul，置37℃避光放置15 min。最后加入2 mol/l的H2SO4终止反应，测定OD450值。

四、结果判断

根据对30份Mhp阴性血清的结果，其均值为0.098，标准差为0.014，得到其阴阳界限值为0.14，因此取OD450≥0.2作为阳性的判定标准。

五、PCR检测方法

1.DNA提取。（1）取200mg待测样品，放到1.5ml EP管中。（2）将待测样品12 000rpm离心2 min。（3）沉淀物加入567 ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30 ul 10%SDS和15 ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1 h。（4）加入100 ul 5 mol/L NaCl, 充分混匀，再加入80 ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10 min。（5）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4～5 min, 将上清转入一只新管中，加入0.6～0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。（6）沉淀用1 ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇。

Mhps的稀释梯度106 105 104 103 102 101 100 PCR +++++－ －ELISA +++++－ －

2.PCR。（1）25ul的反应体系，冰上操作，稍后短时间离心。Template 1ul/3ul、Primer 1 1ul、Primer 2 1ul、2×Master 12.5ul、ddH2O 补至 25ul (9.5ul/7.5ul）。

Primer 1序列为 5’-CCCCCATCCATGAAACC TATTAAAATACCTCTAATTCCT-3’

Primer 2序列为 5’-CCCAAGCTTTTTAAATA TTTTTAATTGCATCTGATAAAT-3’

（2）PCR循环: ①95℃ 5 min、②94℃ 30 s、③53℃ 60 s、④72℃ 60 s(从第2步开始循环30～35个循环）、⑤ 72℃ 7 min、⑥ 4℃

PCR结束后-20℃保存或置于冰上开始电泳，目的片段大小为948 bp。

五、实验方法评价

1.敏感性试验。将CCU检测为1*107.0的Mhp的阳性样品进行梯度稀释，检出的最低浓度定为该方法的灵敏度。

2.重复性及特异性试验。应用该方法对20份阳性病料及10份阴性病料及5份Mhp菌液培养物进行重复，每次间隔时间为一周，共进行6次重复，结果均无差异，说明该方法具有良好的重复性。

应用该方法对猪的其他病毒病及细菌病进行了特异性检测，该方法对副猪嗜血杆菌杆菌、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪胃肠炎病毒、猪流行性腹泻及猪瘟的检测均为阴性，证明该方法具有良好的特异性。

3.样品检测结果。应用本研究建立的双抗体夹心ELISA方法，检测采集自黑龙江、吉林省5个大中型猪场猪只的鼻拭子、组织脏器、全血样品共计128份。并和PCR方法进行了比较，敏感性略低于PCR方法。

阳性 阴性 总计 检出率PCR 42 86 128 32.81%ELISA 41 87 128 32.03%

六、讨论

猪支原体肺炎在世界范围内广泛流行，并且发病率高，一旦暴发就很难控制。虽然目前在对Mhp的研究工作有了很大的进展，但是仍有很多方面工作需要进一步改进。本研究针对目前现地检测的方法进行了相关实验的研究。通过敏感性、特异性及重复性实验结果可以看出，本实验方法具有很好的敏感性、特异性及重复性。并且在利用该方法对现地样品进行检测，方法简便，具有较好的敏感性和重复性，且无交叉反应。方法制备简单，成本低，对现地人员的操作要求较低，适合在现地进行推广。

（略）