野牡丹属植物对大肠杆菌的抑菌效果
2014-09-16江鸣涛唐淑玲白岳峰卓孝康彭东辉
江鸣涛，唐淑玲，白岳峰，卓孝康，彭东辉
(福建农林大学园林学院，福建 福州 350002)
野牡丹属植物对大肠杆菌的抑菌效果
江鸣涛，唐淑玲，白岳峰，卓孝康，彭东辉
(福建农林大学园林学院，福建 福州 350002)
以多花野牡丹(Melastoma.affine)为试验材料，以无菌水为提取剂，通过纸片扩散法对多花野牡丹水提取物进行大肠杆菌的抑菌试验。采用水浴时间、水浴温度、料液比3因素3水平正交试验筛选野牡丹属(Melastoma)植物叶抑菌物质的最佳提取条件，结果表明：提取温度60 ℃，浸提时间2 h，料液比1∶30为最佳提取条件；并采用最佳提取条件对部分野牡丹属植物叶水提取物的抑菌能力进行比较，结果表明：野牡丹属植物叶的水提取物抑菌能力大小为：毛菍(M.sanguineum)>枝毛野牡丹(M.dendrisetosum)>细叶野牡丹(M.intermedium)>多花野牡丹。
野牡丹属；大肠杆菌；纸片扩散法；抑菌效果
野牡丹属(MelastomaL.)植物不仅具有极高的观赏价值，而且具有较高的药用价值[1-3]。研究证明野牡丹(Melastomacandidu)、多花野牡丹 (Melastomaaffine)中含有鞣质、酚类及黄酮类等多种生物活性物质，具有抗菌、抗炎、镇痛、抗癌、抗血小板聚集、扩张冠状动脉、自由基清除、抗氧化等功能[4]，临床使用大都是用水煎液，对大肠杆菌有抑菌作用；动物毒性试验未见有异常反应[5]。野牡丹属植物以多花野牡丹分布最广泛且在临床上运用较多，具有一定的代表性。多花野牡丹水煎液对大肠杆菌的抑菌物质的最佳提取条件，及同属的枝毛野牡丹 (M.dendrisetosum)、毛菍 (M.sanguineum)、细叶野牡丹(M.intermedium)水提取物对大肠杆菌的抑菌试验尚未见报道。鉴于野牡丹属植物在临床运用上的巨大潜力，本试验以多花野牡丹为对象，优化野牡丹属植物叶抑菌物质的提取方法，同时对野牡丹属的多花野牡丹、毛菍、枝毛野牡丹、细叶野牡丹的叶片水提取物对大肠杆菌的抑菌能力进行比较，以期对野牡丹属植物药用价值的开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本试验于2012年5月在福建农林大学艺术学院、园林学院实验中心完成。多花野牡丹叶和细叶野牡丹叶采于福建农林大学校内，毛菍叶及枝毛野牡丹叶采集于海南吊罗山国家级自然保护区。2012年5月采集叶片，将新鲜的叶片洗净、晾干后放入烘箱中，105 ℃中杀青10 min，然后在60 ℃条件下烘干至恒重，后研磨成粉末，收集于自封袋中，保存在4 ℃的冰箱中备用。
供试菌种：大肠杆菌 (Escherichiacoli)由福建农林大学生命科学学院提供。培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。
1.2 仪器
SW-CJ-2FDA型双人单面净化工作台，DNP-9052BS-Ⅲ电热恒温培养箱。
1.3 试验方法
1.3.1 多花野牡丹叶抑菌物质的提取 以无菌水为提取溶剂，设水浴时间(A)、水浴温度(B)、料液比(C)3因素3水平，采用L9(34)正交试验进行多花野牡丹叶抑菌活性成分的提取。按表1称取不同质量的多花野牡丹叶片粗粉放入烧杯，并加入相应比例无菌水，密封后置于相应温度的水浴锅中进行水浴加热，控制相应的水浴时间，通过过滤得到9种供试液。
表1 因素水平表
1.3.2 菌悬浊液的制备 大肠杆菌用牛肉膏蛋白胨培养基斜面活化，扩大培养，24 h后刮取菌苔，然后用无菌生理盐水配制成 106～107cfu·mL-1菌悬液[6]。
1.3.3 多花野牡丹叶水提取物的抑菌试验 采用纸片扩散法测定抑菌活性，制备直径6 mm的滤纸片若干，放入干燥的试管内，经121 ℃湿热灭菌30 min，取出后烘干，浸润于试液中[7]。在无菌条件下，用移液枪分别移取106～ 107cfu·mL-1的大肠杆菌悬液0.4 mL于9个培养皿中，与45 ℃左右的灭菌培养基20 mL混合，轻轻晃动培养皿，使两者充分混合，待含菌培养基凝固后，将浸有不同试液的滤纸片贴于培养基上，每个培养基等距放置3个滤纸片，以浸润无菌水的滤纸片为对照。将培养皿用保鲜膜包裹好并翻转，置于37 ℃恒温箱中培养24 h后，量取抑菌圈直径，直径越大抗菌活性越强。试验重复3次，计算平均值。
1.3.4 野牡丹属植物叶水提取物抑菌能力的比较 分别称取多花野牡丹、细叶野牡丹、枝毛野牡丹、毛菍的叶片粗粉，用无菌水提取，按照多花野牡丹叶提取物抑菌正交试验所得最佳组合，进行水浴加热。通过过滤得到4种供试液。在无菌条件下，用移液枪分别移取大肠杆菌悬液0.4 mL于培养皿中，再分别加入相应的叶水提取液1 mL，与45 ℃左右的灭菌培养基20 mL混合，轻轻晃动培养皿，使两者充分混合，待含菌培养基凝固后，用保鲜膜包扎好培养皿。将平板反转在37 ℃恒温培养箱培养24 h后，采用平板菌落计数法计算各个培养基的菌落个数[8]，用l mL无菌水代替叶提取液的平板作为空白对照。试验重复3次，计算平均值。抑菌率=(空白试验的菌落数-加样试验的菌落数)/空白试验的菌落数。
2 结果与分析
2.1 最佳提取条件筛选
由表2可知，在不同培养条件下，多花野牡丹叶水提取物均有抑菌能力。处理5抑菌圈直径最大，平均值为8.69 mm；处理6抑菌圈直径最小，平均值为6.36 mm。极差数据表明，料液比对抑菌物质的影响最大，提取时间次之，提取温度影响最小。多花野牡丹叶抑菌物质的最佳提取组合为处理5(A2B2C3)，即提取时间2 h，温度60 ℃，料液比1∶30，在该组合条件下多花野牡丹叶抑菌物质对大肠杆菌的抑菌作用最为显著。
方差分析结果表明：水浴温度对多花野牡丹叶提取液的抑菌作用影响不显著(F水浴温度=5.830
表2 不同提取条件对多花野牡丹叶水提取物抑菌能力的影响
表3 不同水浴时间处理的多重比较
*：*为在0.05水平上差异显著。下同。
表4 料液比水平处理的多重比较
2.2 抑菌能力比较
按照多花野牡丹试验优化所得的最佳提取条件：料液比1∶30、水浴温度60 ℃、水浴时间2 h，对多花野牡丹、细叶野牡丹、枝毛野牡丹、毛菍的叶片粗粉进行抑菌活性成分提取，并进行抑菌试验。结果(表5)表明，在相同提取条件下，4种野牡丹属植物叶提取物抑菌能力大小为：毛菍>枝毛野牡丹>细叶野牡丹>多花野牡丹，抑菌率均大于70%。
表5 不同野牡丹植物叶水提取物抑菌能力比较
3 结论与讨论
试验结果表明，多花野牡丹叶抑菌物质的提取条件的最佳组合为：提取时间2 h，水浴温度60 ℃，料液比为1∶30；水浴温度对多花野牡丹叶抑菌物质的提取影响不显著，水浴时间和料液比则对多花野牡丹抑菌物质的提取影响显著；水浴时间过长会导致多花野牡丹叶抑菌物质的减少，而在一定范围内减小料液比的比值则有利于多花野牡丹叶抑菌物质的提取，提高抗菌活性。多花野牡丹、细叶野牡丹、枝毛野牡丹、毛菍对大肠杆菌均有抑制效果，各类野牡丹的叶水提取物抑菌能力大小为：毛菍>枝毛野牡丹>细叶野牡丹>多花野牡丹。
抑菌剂发挥作用的主要途径是通过抑制微生物细胞的膜透性或某些酶活性从而抑制代谢过程，也有许多抑菌剂是作为代谢拮抗物影响新陈代谢的进行而发挥抑菌作用[9]。有关研究表明，通过对多花野牡丹不同部位及不同溶剂进行试验，表明叶片的抑菌活性物质要高于枝条含量，乙醇对抑菌物质的萃取能力高于无菌水[7]，本试验则在此基础上，选择叶片作为材料，同时采用无菌水作为溶剂，与临床运用相结合，针对水浴温度、水浴时间、及料液比进行进一步研究分析，探讨三者对抑菌物质提取的影响，对实际药用具有一定参考价值。通过野牡丹属植物抑菌能力的比较结果表明毛菍、枝毛野牡丹、细叶野牡丹均有抑菌能力且强于多花野牡丹，具有巨大的开发潜力和应用价值，今后可以对相关种的抑菌能力和试验方法进行更深入的探讨，进一步开发野牡丹属植物的药用价值。本试验的结果是通过体外抑菌试验得到的，野牡丹属植物在机体内的杀菌效果以及抑菌机理还有待进一步研究。
[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第53卷：第1分册[M].北京：科学出版社，1984：156.
[2]国家医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科技出版社，2000：675-683.
[3]中国植物志编委会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1984：154-162.
[4]姚亮亮，刘新亚.野牡丹属植物的化学成分、药理活性及临床应用研究概况[J].江西中医学院学报，2010，22(6)：52-55.
[5]姚菊玲，唐昌越，何平，等.多花野牡丹治疗宫颈糜烂300例临床观察[J].河南中医，1990，10(5)：24-25.
[6]曾超珍，刘志祥.枸骨叶抑菌物质的提取及抑菌作用研究[J].北方园艺，2009(8)：129-131.
[7]苏燕评，周孙英，刘剑秋.多花野牡丹的抑菌活性及总黄酮含量测定[J].植物资源与环境学报，2005，14(1)：56-57.
[8]刘毅，袁月华.几种常用植物性食物原料成分对大肠杆菌的抑菌作用研究[J].中国调味品，2007(12)：37-40.
[9]林捷，吴锦铸，朱新贵，等.柚皮提取物的抑菌作用研究[J].华南农业大学学报，1999，20(3)：59-62.
Study on Bacteriostatic of Melastoma onEscherichiacoli
JIANG Ming-tao，TANG Shu-ling，BAI Yue-feng，ZHUO Xiao-kang，PENG Dong-hui
(LandscapeCollege，FujianAgriculturalandForestryUniversity，Fuzhou350002，Fujian，China)
Melastomaaffinewas used as test material and the aspetic water was as extractant.The antibacterial activity ofMelastomaaffineleaves to Escherichia coli was studied by disc diffusion method，An orthogonal test which includes water bath time，water bath temperature，and ratio of solid to liquid at three different levels was used to determine the optimum extractive condition of antifungal substance ofMelastomaleaves.The results showed that the optimum extractive conditions was leaching-temperature 60 ℃，extracting time 2h，ratio of solid to liquid 1∶30.Under the optimum extractive condition，the antibacterial activity of parts ofMelastomaL. leaves were compared，the result showed the ability of bacteriostatic wasM.sanguineum>M.dendrisetosum>M.intermedium>M.affine.
MelastomaL.；Escherichiacoli；disc diffusion method；bacteriostatic effect
10.13428/j.cnki.fjlk.2014.03.014
2013-09-10；
2013-10-28
福建省林业厅资助项目(野牡丹科植物种质资源保护与利用推广，闽林推[2011]5号)
江鸣涛(1990—)，男，福建平和人，福建农林大学园林学院在读硕士研究生，从事园林植物研究。E-mail：601695833@qq.com。
彭东辉(1971—)，男，福建屏南人，福建农林大学园林学院教授，博士，从事园林植物资源与应用研究。E-mail：fjpdh@126.com。
S767.1+6；Q946.887
A
1002-7351(2014)03-0061-04
