紫甘蓝COP1基因的克隆及表达模式分析

张彬，路阳，尹美强，温银元，赵娟，王玉国

(山西农业大学 农学院， 山西 太谷 030801)

紫甘蓝COP1基因的克隆及表达模式分析

张彬，路阳，尹美强，温银元，赵娟，王玉国

(山西农业大学 农学院， 山西 太谷 030801)

光照是植物生长发育的一个重要的环境因素，COP1是光调控植物发育的一个分子开关。本实验以“早红”紫甘蓝为实验材料，分两组置于光照(光照16 h，28℃；黑暗8 h， 18℃)及完全遮光培养箱培养，至幼苗时提取RNA，进行COP1的cDNA克隆，并通过半定量RT-PCR方法分析COP1在不同处理下的表达情况。结果表明：COP1 cDNA全长为1863 bp，编码620 aa，分子量为70.325 kD；在无光条件下生长的紫甘蓝幼苗虽然仍有少量花青素合成，但是其花青素含量明显低于光照条件下生长的紫甘蓝幼苗；COP1基因在无光条件下的表达量明显强于有光条件，表明COP1对紫甘蓝中花青素的合成起负调控作用。本文旨在探索在不同光照条件下紫甘蓝中COP1基因与其花青素合成的关系，为后期揭示花青素表达调控机制奠定基础。

紫甘蓝；花青素；COP1；基因克隆；半定量RT-PCR

光是植物生长发育过程中一个不可缺少的环境因素，植物通过叶绿体在光照下完成光合作用，为植物生长提供养分，对植物幼苗的形态建成和生长发育起重要作用。研究发现，当幼苗在有光条件生长时，会发生光形态建成[1，2]：即胚轴部缩短，子叶大且伸展，含有丰富且发达的叶绿体，幼苗去黄化；而当幼苗在暗处生长时，其顶端弯曲，子叶小且不展，幼苗形成黄化质体且叶绿体缺乏，称为暗形态建成。利用转座子标签法，邓兴旺实验室获得了拟南芥COP1突变体并克隆了COP1(constitutively photomorphogenic 1)基因，它编码的蛋白COPl是光调控植物发育的一个分子开关(molecular switch)。在暗环境中COP1蛋白位于细胞核内，参与泛素化降解光信号途径中的正调控因子HY5，抑制植物的光形态建成；而在光照下，COP1在植物分散到细胞质中，从而使得植物光形态建成恢复。在核内，COP1与多个转录因子作用共同调节植物的形态建成[3，4]。在高等绿色植物中，COP1基因首次从拟南芥中分离并鉴定了其功能[5]，除拟南芥外，现已从菊目[6](向日葵，莴苣)、芜菁[7]、可可[8]、豌豆[9]、甘蓝型油菜[10]等植物中获得cDNA的克隆及功能研究，并研究了COP1在水稻中时空表达分析[11]。甘蓝为世界性栽培蔬菜，在中国各地均有栽培，特别是东北、西北、华北等较冷地区春、夏、秋的主要蔬菜。紫甘蓝为甘蓝的一种，且富含花青素，即甘蓝的主要价值体现在食用、药用及观赏价值上。本文就紫甘蓝置于不同光照处理下COP1基因表达模式进行初步研究，旨在探索不同光照处理下COP1对高花青素含量蔬菜紫甘蓝的作用机理，为后期揭示花青素表达调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验采用的紫甘蓝种子购自重庆天子种业有限公司；RNA提取试剂盒RNAiso Plus，Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶等均购自大连TaKaRa公司；反转录酶M-MuLV RT、DNA消化酶RQ1 Rnase-Free Dnase采用Promega公司的产品；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)是北京TIANGEN公司产品；抗生素购自Sigma公司；Marker DL5000+购自北京天为时代科技有限公司。其余试剂均为进口或国产分析纯试剂。引物合成和基因测序均由上海英骏生物技术公司完成。克隆载体pMD18-T为TaKaRa的公司产品。大肠杆菌菌株DH5α由本实验室保存。

1.2 植物材料

将“早红”紫甘蓝种子分两组，一组置于光照(光照16 h，28℃)与黑暗(黑暗8 h， 18℃)培养箱，另一组放到密闭盒子后置于光照培养箱底层进行遮光处理(无光)培养。两种处理的紫甘蓝种子均播种于含3层纱布的组培瓶中，将纱布、蒸馏水、组培瓶提前进行高温高压灭菌，种子用75%的乙醇消毒，之后用已灭菌的蒸馏水冲洗多次播种。当幼苗长至一定高度时取材(图1)。

1.3 RNA的提取

分别称取新鲜幼苗1 g，放入用液氮预冷的研钵中，加入液氮并研磨至粉末状，按照TaKaRa公司RNA提取试剂盒RNAiso Plus说明书的操作来提取各材料中的总RNA。

图1 紫甘蓝在光照和避光培养生长状况

1.4 cDNA的合成

以2 μg总RNA为模板，按照Promega公司M-MuLV RT反转录酶的说明书，使用本实验室自行设计的反转录引物dT-R进行反转录，获得cDNA。

1.5 COP1基因的克隆与测序

根据GenBank已登录的其它物种COP1基因序列，按照同源基因克隆的方法，利用Primer 5.0设计全长克隆引物：上游QCOP1-F：5-TAGGAAGGATCCGCTAGTT-3，下游QCOP1-R：5-AAAGTGGAACAAGAAATCATC-3。以反转录合成的cDNA为模板，利用高保真酶Primer Star来扩增目标基因。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，54℃复性30 s，72℃延伸2 min，40个循环；最后72℃延伸10 min。取5 μL扩增产物，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。将切胶回收的DNA片段连接到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α菌株，Amp筛选，PCR鉴定片段大小后送样测序。

1.6 COP1基因的生物信息学分析

利用NCBI的ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) 来分析开放阅读框；利用CLUSTALX和MEGA 4.0对紫甘蓝、芜菁、拟南芥、油菜、蓖麻、毛白杨、豌豆、苜蓿、番茄、苹果COP1的氨基酸序列进行比对；利用ExPASy(http://www.expasy.org/vg/index/Protein)分析蛋白质结构及其理化性质；利用MEGA 4.0进行系统进化树分析。

1.7 半定量RT-PCR分析紫甘蓝光照及遮光处理下COP1在幼苗中的表达情况

根据已克隆的紫甘蓝COP1基因序列，利用Primer 5.0设计半定量RT-PCR引物：上游COP1F：5′-TCCAGAAGAGGCGTCAGT-3′，下游COP1R：5′-CATCTCGAAACACCAGCA-3′。以看家基因EF1A作为内参基因(EF1A-F：5-ATCCCGTTGCTTTCACTGC-3， EF1A-R： 5-CCGTACACATCCTGGTTTC-3)。将反转录的cDNA稀释3倍作为模板，利用普通rTaq酶扩增目的基因片段及内参基因。通过不同循环数下扩增，得到最优扩增循环，28循环，在此循环下进行EF1A和COP1的扩增，反应程序设置为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃复性30 s，72℃延伸30 s，28个循环；最后72℃延伸5 min。取5 μL扩增产物，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，调整EF1A扩增产物上样量，使得在光照和暗处两处理下EF1A亮度达到一致，以该上样量分别检测COP1扩增产物，分析两个处理下COP1的表达情况。

2 结果与分析

2.1 紫甘蓝cDNA的合成与COP1基因的克隆

提取的RNA电泳图条带清晰完整，28S与18S的条带亮度比约为2∶1，表明RNA的质量很高，符合实验要求，可以用于反转录合成cDNA。以提取的光照和黑暗处理的紫甘蓝幼苗RNA为模板进行反转录后，用特异性全长引物QCOP1-F/QCOP1-R扩增目的基因COP1，电泳图显示分别克隆得到约2.2 kb的片段(图2)。将目的片段连接到pMD18-T载体中。PCR鉴定结果表明特异性引物分别扩增得到约2.2 kb的目的片段，与预测结果一致，证明目的片段已经成功连入pMD18-T载体中。送样测序。

2.2 紫甘蓝COP1基因特征分析

测序结果表明，从光照和黑暗培养下的紫甘蓝cDNA克隆都得到了长度为2234 bp的cDNA序列，该序列包含了1863 bp的ORF(open reading frame，ORF)序列，编码了620个氨基酸，分子量约70 kD，pI为7.30，见图3。

图2 COP1基因cDNA全长的RT-PCR扩增

2.3 紫甘蓝COP1基因的生物信息学分析

2.3.1 开放阅读框以及蛋白质保守位点分析

ORF Finder分析结果显示紫甘蓝的COP1基因由一个完整且连续的开放阅读框组成；对紫甘蓝、芜菁、拟南芥、油菜、蓖麻、毛白杨、豌豆、苜蓿、番茄、苹果进行氨基酸序列比对，发现紫甘蓝、青甘蓝COP1蛋白与多种植物的COP1有很高的同源性，COP1蛋白的保守位点见图4。

2.3.2 氨基酸组成以及理化性质分析

紫甘蓝COP1编码了620个氨基酸，相对分子质量为70 325.2，等电点(pI)为7.30；芜菁COP1编码了677个氨基酸，相对分子质量为76 468.0，等电点为6.39；油菜COP1编码了677个氨基酸，相对分子质量为76 468.0，pI为6.39；拟南芥COP1编码了675个氨基酸，相对分子质量为76 187.6，pI为6.38。

2.3.3 蛋白质亲疏水性分析

通过在线软件ExPASy中的ProtParam工具对紫甘蓝、芜菁、油菜及拟南芥COP1的亲疏水性进行了分析。结果显示紫甘蓝COP1的GRAVY(Grand average of hydropathicity)值为-0.530；芜菁COP1的GRAVY值为-0.554；油菜COP1的GRAVY值为-0.554；及拟南芥COP1的GRAVY值为-0.556。以上结果说明这4个蛋白都是亲水性的。

图3 紫甘蓝COP1全长 cDNA核苷酸序列及其蛋白质序列

图4 多种植物COP1蛋白一级结构比较

2.3.4COP1系统进化树分析

通过MEGA 4.0对不同科属的作物进行了COP1进化树分析，如图5所示，结果显示甘蓝与芜菁、油菜亲缘关系最近。

图5 COP1蛋白在紫甘蓝及相近物种的进化系统图

2.4 紫甘蓝光照和黑暗处理下COP1表达情况分析

利用半定量RT-PCR方法分析紫甘蓝幼苗在光形态建成和暗形态建成过程中COP1 的表达丰度(图6)。图1结果表明：不同光照条件下幼苗的形态差异很大，光照条件下生长的紫甘蓝幼苗中因积累了大量的花青素而呈现为紫红色(电子版)，而黑暗条件下生长的紫甘蓝幼苗虽仍有少量花青素积累，但其花青素含量显著低于光照条件下生长的幼苗，因此呈现为浅紫色；半定量结果表明，在黑暗条件下COP1基因的表达量显著强于光照条件下，这个结果与其表型相反，据此推测，紫甘蓝中COP1基因的表达受光照的抑制，COP1基因对紫甘蓝中花青素的合成起一个负调控的作用。

图6 半定量RT-PCR分析紫甘蓝光照和黑暗培养下COP1表达情况

3 讨论

COP1蛋白是光形态建成的一个抑制子，是光调控植物发育的一个分子开关。当植物在暗处生长时，核内会积累有丰富的COP1蛋白，光形态建成受到抑制。分析表明光下生长的拟南芥幼苗中COP1蛋白的水平与黑暗中生长的拟南芥无明显差异[12]，而本实验基于高花青素含量的紫甘蓝品种，在一定时间光照及完全避光处理下考察COP1的表达与光形态建成的关系。

通过表型观察，培养一段时间两种幼苗的形态建成及花青素的含量由于受到光的影响呈现不同颜色，相对于光照培养的正常花青素含量紫甘蓝幼苗，遮光处理下幼苗花青素含量急剧降低，但在胚轴上端及子叶部分仍有部分花青素积累而呈浅紫色。而黑暗条件下COP1基因表达却强于光照条件下，表型结果与半定量RT-PCR结果表明，光照能极大影响紫甘蓝花青素的合成与积累，推测可能是在黑暗条件下，由于COP1在核内通过参与泛素化降解光信号途径中的正调控因子，抑制植物的光形态建成，而光照又是植物合成花青素的前提，但仍有少量花青素合成，推测可能在花青素合质中，恢复了光形态建成，也可能被一些调控因子所分解，使得光照下COP1表达量低于黑暗处理下。前人对COP1功能研究仅限于WD-40重复结构域的相互作用而抑制所有启动子中含有G-box 的光诱导基因的表达活性[13]。对COP1与紫甘蓝中花青素合成途径关系的作用机理还未曾报道。

李亚丽等[14]研究发现，紫甘蓝中结构基因的强表达利于花青素的合成与积累。而结构基因的表达差异主要发生在花青素合成途径的中、下游。因此，后续研究可以进一步探索COP1基因对花青素合成途径各结构基因的作用位点，及调控花青素与光形态建成的相关转录因子对紫甘蓝花青素合成代谢的影响。

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CloningandExpressionPatternAnalysisofPurpleCabbageCOP1Gene

Zhang Bin, Lu Yang, Yin Meiqiang, Wen Yinyuan，Zhao Juan, Wang Yuguo

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

Light is the most influential environmental factor, affecting the plant growth and development, otherwiseCOP1 is a molecular switch of light regulation for the plant development. In this experiment, "Zaohong" purple cabbage as experimental material, is divided into two groups placed in the light (light 16 h, 28℃; dark 8 h, 18℃) and completely shading incubator. RNA was extracted when it grew to seedlings, the cDNA ofCOP1 gene was cloned. We analyzedCOP1 expression pattern under different processing by semi-quantitative RT-PCR method. The full-length cDNA sequence ofCOP1 was 1863 bp, encoding 620 amino acids, with a molecular weight of 70.325 kD. Specially, the purple cabbage seedling still produce anthocyanins in dark conditions, and the content of anthocyanins of the purple cabbage seeding grown in dark conditions significant lower than the seeding grown in light conditions. The expression level ofCOP1 gene in dark conditions is clearly higher than that in light conditions, it indicated thatCOP1 gene played a negative regulatory role to the synthesis of anthocyanins in purple cabbage. The purpose of this paper is to explore the relationship between the synthesis of anthocyanin andCOP1 gene under the different illumination condition in the purple cabbage, and to lay the foundation for revealing anthocyanins expression regulation mechanism.

Purple cabbage；Anthocyanin；COP1；Gene cloning；Semi-quantitative RT-PCR

2014-06-24

2014-07-10

张彬 (1982-)，女(汉)，山西太原人，讲师，博士，研究方向：植物生理与分子生物学。

山西省青年科技研究基金(2013021024-2)；山西农业大学科技创新基金(201302)；山西农业大学引进人才博士启动基金(2012YJ12)

Q785；S635

A

1671-8151(2014)05-0385-06

(编辑：武英耀)