基于时间－反应法评估半数死亡时间

徐镜波，李铸衡，李 爽

（东北师范大学环境学院，湿地生态与植被恢复国家环保部重点实验室，吉林 长春 130117）

水生生物的急性和慢性致死试验具有相对廉价和容易操作、可以很快地获得数据的优点，因而在过去的几十年里，这些试验构成了化学物质毒性评价、环境管理的基石，在确定点源污染效应和比较物质毒性方面起到了很大的作用.然而，目前大多数实验室对于受试化合物的暴露研究，通常是受试生物在整个实验中被暴露在持续恒定的受试化合物浓度中，这种稳定的暴露条件不可能完全切合野生物种的现实暴露状态［1］.因此，由上述这种广泛应用的经典方法——“持续恒定浓度暴露”获得的半致死或半效应剂量／浓度，在某种程度上也具有许多局限［2－3］.

水生生物总是暴露于各种环境污染物随时间变化的波动起伏中.表面水的流失和相关的水解稀释、扩散激流的沉淀析出，以及环境污染物活性的降解都能够产生脉冲式暴露.因此一个简单的时间－不变的暴露模式不太可能代表水生生物在自然生境中所遭遇的不断波动变化的环境浓度.准确地度量暴露时间的效应对于评价污染物生态毒理方面的结果是非常重要的.为了达到这一目的，本文利用时间－反应法（time－response approach）为剂量／浓度－反应方法做补充，探讨污染物脉冲式暴露的水生态毒理效应.在时间－反应方法中，测量的是死亡时间，从每个暴露浓度梯度中获得更多的数据，因此提高了统计效能.虽然有这么多明显的优点，生态毒理学者目前仍然未对时间－反应方法充分加以利用［4］.本文基于时间－反应法，重点阐明、评估了水生生物污染暴露的半数死亡时间（median lethal time，LT50，T50）的模型基础与数据拟合的方法.

1 时间－反应法

1.1 死亡时间

为了准确地度量暴露的时间效应，时间－反应方法测量的是死亡时间（TTD，time to death），即从每个污染暴露的实验中能够获得更多的数据，因此提高了统计效能，对于评价污染物生态毒理效应也是极其重要的.例如，在盛有10条鱼的暴露容器中，可以得到10条鱼的10个死亡时间——TTD值，而不只是一个比例.

存活时间法观察的终点——死亡时间是与每个个体相关的，是把效应作为暴露时间和浓度的共同函数来加以预测.图1显示了发生在6个不同浓度下的理想化的死亡比例时间进程［4］.如果图1中只用96h的实验数据，LC50的计算仅仅用了5个点；如果观察记录个体的死亡时间数据而不仅仅是死亡比例，则可以产生更多的数据点，提高了统计效能［4］.

1.2 时间－反应数据的拟合

基于死亡时间概念和时间－反应的相关模式，建立分析时间－反应数据的方法.观察记录的个体实验数据可以被直接运用或者经过转换.通常，转换的目的是使时间和反应之间的关系呈线性［4］.在生物毒性试验中，测量数据或经过转换的测量数据，即时间以及效应的测量数据都可以用于时间－反应数据的分析.

图1 死亡率与死亡时间的关系

半致死时间LT50值及相应置信区间是由时间－反应模型得出的最常用的统计量.LT50是在预定的浓度下导致50%被暴露个体死亡的时间.概率单位（Probit）转换来自于正态等差（normal equivalent deviation，NED），即以距正态曲线平均值的标准差数表示的死亡比例.首先，观察记录在一系列暴露时间下被暴露个体反应的比例.以反应比例的概率单位t值对暴露时间的对数作图，可以生成一条如图2所示的直线［4］.

图2 死亡率、概率单位与时间的关系

LT50值及相应置信区间估计的步骤如下：

首先，观察记录个体的死亡时间数，列出在一系列暴露时间下被暴露个体反应的比例.以反应比例的概率单位值对暴露时间的对数作图，以生成一条如图2的直线.用目测法在这些数据上画一条直线，导致50%死亡率的概率单位值对应的时间就是估计的LT50.

第二，计算95%置信区间.和剂量－反应数据一样，死亡随时间的分布可以从图2中的一系列数据选择.估计LT50的方法是一种半图解法［4］.如图3所示，线上对应于16%，50%和84%死亡率的点用来估计LT50及其95%置信区间.相应于P＝0.50的时间对数值的反对数就是 LT50.斜率因子（S）由16%（LT16），50%（LT50）和84%（LT84）死亡率的相应时间计算得出［4］：

图3 时间－反应关系

式中：S为斜率因子；a为16%死亡率的时间（LT16值）；b为50%死亡率的时间（LT50值）；c为84%死亡率的时间（LT84）.

用从这条线得出的斜率因子来计算95%置信区间.式中，LT16，LT50和LT84分别是16%，50%和84%暴露个体死亡时对应的时间.然后计算f值（用S以及处理中在LT16和LT84之间被暴露的动物总数N求得），估计LT50值的95%置信上下限：

2 水生生物污染暴露的半数死亡时间

受试化合物为第二松花江典型污染物邻二硝基苯（1，2－DNT），污染暴露的受试水生生物为敏感鲤鱼幼鱼.根据预试验及LC50值结果，被测物浓度梯度设置为5.6，4.2，3.2mg／L，基于时间－反应法评估的水生生物污染暴露半数死亡时间（LT50）的测定结果如表1所示.

表1 实验数据

LT50及相应置信区间估计的步骤如下：

（1）将死亡时间转换为死亡时间的对数值（见表1）.

（2）利用概率单位换算表（见表2），将死亡百分数转换成概率单位.

（3）根据概率单位作图法，将死亡时间对数和死亡百分数转换成的概率单位作图，顺着绘出点分布趋势作一条直线.将表1中5.6，4.2，3.2mg／L浓度组的死亡时间对数（x）和死亡百分数概率单位（y）作图；或者进行两者的直线回归方程分析.

（4）如图2（右图）、图3，从纵轴的概率单位为5处作一平行于横轴的平行线，与所作直线必有相交之“点”，再自这“点”作横轴的垂线，交横轴之点所对应的值即为LT50的对数.最后，查反对数，得到5.6，4.2，3.2mg／L质量浓度下的LT50值分别13.10，39.20，110.10min（见表1）.

（5）同时，求直线的回归方程，也就是时间与反应关系的回归方程.依据SPSS17.0得到死亡时间对数（x）和死亡百分数转换成的概率单位（y）的直线回归方程和LT50值：

直线回归方法获得的5.6，4.2，3.2mg／L浓度下的LT50值分别13.46，39.77，112.26min，与表1中用概率单位作图法获得的三个浓度下的LT50值相同.

（6）求LT50的置信限.按式（1）和（2），求斜率因子（S），f，得到LT50的置信限：

5.6mg／L浓度组LT50的置信限：10.68～16.96min.

4.2mg／L浓度组LT50的置信限：32.33～48.92min.

3.2mg／L浓度组LT50的置信限：80.40～129.68min.

表2 概率单位换算表

3 结语

由于现今标准恒定暴露的毒性实验测量的局限，传统的实验室毒性实验迄今为止几乎不能特定地完成现实环境中时间－改变的暴露效应评价.本文基于时间－反应法，介绍了鲤鱼幼鱼暴露于1，2－DNT的LT50数据拟合与处理方法.期望随着与传统剂量或浓度－反应试验方法（LD50／LC50或ED50／EC50）能有效结合，进一步丰富生态毒理学的研究内容.

［1］HYNDMAN K M，BIALES A，BARTELL S E，et al.Assessing the effects of exposure timing on biomarker expression using 17β－estradiol［J］.Aquatic Toxicology，2010，96：264－272.

［2］DIAMOND J M，KLAINE S J，BUTCHER J B.Implications of pulsed chemical exposures for aquatic life criteria and wastewater permit limits［J］.Environmental Science and Technology，2006，40：5132－5138.

［3］ZHAO Y，NEWMAN M C.Shortcomings of the laboratory－derived median lethal concentration for predicting mortality in field populations：exposure duration and latent mortality［J］.Environmental Toxicology Chemistry，2004，24：2147－2153.

［4］NEWMAN M C，UNGER M A.Fundamentals of ecotoxicology［M］.USA：Lewis Publishers，2003.