青龙衣的化学成分和抗肿瘤活性研究

黄成钢，阎新佳，邹晓祺，刘 影，李 钧，辛国松，李 博，季宇彬

(1.哈尔滨商业大学药物所博士后科研工作站，哈尔滨 150076；2.哈尔滨商业大学药学院，哈尔滨 150076；3. 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076)

青龙衣为胡桃科植物核桃(Juglansi regia L.)和胡桃楸(J.mandshurica Maxim).的未成熟果皮，味辛、苦，性涩、平，在中国作为中草药应用已有千年的历史，中医多以其清热解毒、祛风疗癣、止痛止痢功效入药.现代药理研究表明青龙衣具有较强的镇痛和抗肿瘤作用，其乙醇粗提物具有较好的细胞毒活性[1-3].研究表明核桃属植物普遍含有二苯庚烷、萘醌、黄酮及苯丙素类化合物[4-7]，为明确青龙衣的抗癌活性物质基础，对青龙衣乙醇提取物进行了系统的化学成分研究，从中分离得到11个单体化合物，通过1H-NMR、EI-MS等技术以及与文献化合物数据对照等方法确定这些化合物分别为正二十九烷醇(nonacosanol)，[1-(4'-甲氧基苯基)-7-(3''-甲氧基,2''-羟基苯基)-3',4''-环氧-3-庚酮[3',4''-epoxy-1-(4'-methoxylphenyl)-7-(3''-methoxyl-2''-hydroxyphenyl)-heptane-3-one]，正三十一烷醇(hentriacontanal)，1-(4'-羟基苯基)-7-(3''-甲氧基-4''-羟基苯基)-庚烷-3-醇1-(4'-hydorxyphenyl)-7-(3''-methoxy-4''-hydorxyphenyl)hepta-3-ol)，4,8-二羟基-3,4-二氢-1-萘酮(4,8-dihydroxy-3,4-dihydro-naphthalenone)，胡桃醌(5-hydroxy-1,4-naphthoquinone)，β-谷甾醇(beta-sitosterol)，齐墩果酸(oleanolic acid)，香草酸(vanillic acid)，槲皮素(quercetin)，香草醛(vanillin).11个化合物均为已知化合物.本文采用MTT法对从中药青龙衣中分离得到的11个化合物进行了抗肿瘤活性筛选，为今后抗肿瘤作用机制以及作用靶点的进一步研究提供理论依据.

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

EYELA SB-2000旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；Bruker-500MHz型核磁共振仪(德国Bruker公司)；G1956A型质谱仪(美国Agilent公司)；CO-150型二氧化碳培养箱(美国NBS公司)；CKX-41-32型倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；Model 680 酶标仪(美国BIO RAD公司)；AR2140分析天平(美国OHAUS公司)；DL-CJ-IND型医用洁净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；反相硅胶C18(北京绿百草科技发展有限公司)；柱色谱硅胶、薄层色谱硅胶(GF254)(青岛海洋化工厂)；注射用羟基喜树碱(HCPT，哈尔滨圣泰药业，20070430)；MTT(Sigma公司)；RPMI 1640细胞培养基、胰蛋白酶(Invitrogen 公司)；胎牛血清(FCS，杭州四季青生物工程材料有限公司)；二甲基亚砜(DMSO，天津市博迪化工有限公司).所用试剂均为分析纯.

青龙衣药材采于黑龙江伊春，经哈尔滨商业大学药学院张德连教授鉴定为胡桃科胡桃树属植物胡桃楸(Juglands mandshurica Maxim.)未成熟果实的干燥肉质果皮.人胃癌细胞株(SGC7901)，人肝癌细胞株(HepG-2)，人肺腺癌细胞株(A549)，人肠癌细胞株(LoVo)，乳腺癌细胞株(MCF7)，由哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心提供.

1.2 提取与分离

取青龙衣药材8.0 kg粉碎至20～30目，加10倍量95%乙醇浸泡12 h再超声提取30 min(40kHz)，过滤，药渣继续加10倍量95%乙醇热回流1 h.过滤，药渣弃掉，合并药液减压浓缩(温度不超过40 ℃)药膏挥至无醇味.得浸膏880.1 g.加水适量使其混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别浓缩回收萃取液.得石油醚萃取层95.0 g、氯仿萃取层120.1 g、乙酸乙酯萃取层15.5 g、正丁醇萃取层80.0 g和水层.对石油醚萃取物(95.0 g)经反复硅胶柱层析，以石油醚-丙酮梯度洗脱，TLC跟踪检查合并相同流分.合并石油醚-丙酮(50∶1)流分，再上硅胶柱层析，石油醚-丙酮(100∶1)洗脱，经丙酮重结晶得到化合物1(25.0 mg).对氯仿萃取物(20.0 g)经反复硅胶柱层析，以氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC跟踪检查合并相同组分，氯仿流分用硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(10∶1)洗脱得到化合物2(2.0 mg)，氯仿-甲醇(200∶1)流分用硅胶柱层析，经氯仿-甲醇(300∶1)洗脱，洗脱流份再经硅胶柱色谱石油醚-丙酮(100∶1)洗脱得化合物3(5.0 mg).氯仿-甲醇(100∶1)流份继续硅胶柱层析，所得主要流分经反相C18处理40%～50%甲醇梯度洗脱得到化合物4(10.0 mg).氯仿-甲醇(50∶1)流份继续硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(10∶1)洗脱，再经硅胶柱色谱甲醇梯度洗脱得到化合物5(5.0 mg).对乙酸乙酯萃取物(15.0 g)反复硅胶柱层析，以氯仿-甲醇梯度洗脱，氯仿-甲醇(200∶1)流份经硅胶柱层析，石油醚-丙酮(200∶1)洗脱得到较纯的Ⅰ和Ⅱ，Ⅰ经石油醚反复重结晶得到化合物6(20.0 mg)，Ⅱ经丙酮反复重结晶得到化合物7(40.0 mg).氯仿-甲醇(150∶1)主要流份继续硅胶柱层析，氯仿-甲醇(200∶1)洗脱首先得到黄色物质，继续上硅胶柱氯仿洗脱，所得的流份经甲醇反复重结晶得到化合物8(10.0 mg).氯仿-甲醇(100∶1)洗脱得到化合物11(10.0 mg).氯仿-甲醇(50∶1)得到的流份经硅胶柱层析，氯仿-甲醇(150∶1)洗脱，所得主要流份在再次经硅胶柱层析氯仿-甲醇(100∶1-50∶1)梯度洗脱，氯仿-甲醇(100∶1)主要流份经ODS柱色谱处理50%～70%甲醇梯度洗脱得到化合物9(10.0 mg)和化合物10(5.0 mg).

1.3 细胞培养

细胞生长至高密度(90%融合)时，吸去原培养液，用PBS洗涤细胞2次，加1 mL胰酶(0.25%)后，在倒置显微镜下观察，当细胞中呈现圆粒状达到50%以上时，吸出胰酶，加入2 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，用滴管将生长于培养瓶壁的细胞吹下，并混合均匀，按1∶4至1∶6的比例转移至新培养瓶后，加适量含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，置于5%、37 ℃、二氧化碳培养箱中培养.

1.4 MTT法筛选化合物的抗肿瘤活性

将处于对数生长期的5株细胞分别用0.25%胰酶消化后，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液稀释成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，以每孔100 μL 接种于96孔培养板中，在37 ℃、CO2培养箱中培养.培养24 h后，给药组加入不同浓度的药品，每孔加100 μL的药液，每孔总液体量为200 μL，每个药物浓度设5个浓度、4个平行孔，空白对照组每孔加100 μL的RPMI 1640培养液，置于37 ℃、5 % CO2培养箱中培养.72 h后，弃上清，在培养板中加入MTT(100 μL/孔)，置于37 ℃继续培养4 h后，小心弃去上清液，每孔加入200 μL的DMSO，在微型振荡器上振荡5 min后，用酶标仪测定OD570nm值，并计算IC50.

生长抑制率% =

× 100 %

2 实验结果

化合物(1)为白色无定型粉末，溶于CHCl3、石油醚中，难溶于水，10%硫酸乙醇溶液显色呈紫红色.ESI-MS (m/z)：425.6 [M+H]+，447.3 [M+Na]+，表明分子质量应为424，结合1H-NMR (CDCl3-d, 500 MHz)，推测该化合物呈现典型的长链脂肪烷醇特征，给出了末端甲基、羟甲基、以及链中(CH2)n质子，δH 0.96 (3H, t, J = 6.8 Hz)为末端甲基质子信号.δH 1.29 (52H, brs)提示该化合物存在 (CH2)26的片段.δH 3.53 (2H, t, J = 6.8 Hz), 1.48(2H,m)分别为羟甲基和相邻的亚甲基质子信号，将化合物1的1H-NMR数据与文献[8-9]中的正二十九烷醇对照，波谱数据基本一致，故鉴定化合物1为正二十九烷醇(nonacosanol).

化合物(2)为白色针状结晶(甲醇)，易溶于有机溶剂，难溶于水.三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，提示结构中有酚羟基存在.ESI-MS给出356 [M]+，表明分子质量应为356.在1H-NMR(DMSO-d6,500 MHz)中，存在一组ABX偶合芳香质子信号：δH 6.68 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.92 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz) 和4.14 (1H, d, J = 2.0 Hz)；一组AB偶合系统的芳香质子信号：δH 6.42 (1H, d, J = 8.0 Hz)，6.68 (1H ,d , J = 8.0 Hz) 提示该化合物中纯在两个苯环.高场区根据偶合常数也可以观察到共有6组氢信号，每组均为两个偕偶氢；除以上信号外，3.66 (3H, s)，3.82 (3H, s) 有两个甲氧基信号.5.44 (1H, brs)处为一个宽单峰，提示为羟基信号峰.以上数据与已知文献[10]对照基本一致，故鉴定化合物2为[1-(4'-甲氧基苯基)-7-(3''-甲氧基,2''-羟基苯基)-3',4''-环氧-3-庚酮[3',4''-epoxy-1-(4'-methoxylphenyl)-7-(3''-methoxyl-2''-hydroxyphenyl)-heptane-3-one].

化合物(3)为白色固体粉末，溶于石油醚，氯仿，难溶几乎不溶于水；ESI-MS (m/z)：453.6 [M+H]+，475.3 [M+Na]+，表明分子质量为452，1H-NMR (CDCl3-d, 500 MHz) 谱呈现出典型的脂肪烷醇特征，给出了末端甲基、羟甲基、以及链中(CH2)n质子，δH 0.86 (3H, t, J = 6.4Hz) 为末端甲基质子.从δH1.27 (56H, brs) 处为一多个亚甲基集合在一起给出的宽峰，应为链中(CH2)28片段.δH1.57 (2H, m)为羟甲基相连亚甲基.δH3.66 (2H, t, J = 6.8 Hz) 为羟甲基上的2个质子，与文献[11-12]对照基本一致，因此鉴定化合物3为正三十一烷醇(hentriacontanal).

化合物(4)为黄色油状物，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，示存在酚羟基.ESI-MS (m/z)：331.0 [M+H]+，353.2 [M+Na]+，所以推测分子质量为330.1H-NMR (CDCl3-d, 500 MHz) 谱中，δH 6.71 (1H, d, J = l.7 Hz), 6.54 (1H, d, J = 7.1 Hz), 6.54 (1H, dd, J = 7.1, 1.7 Hz) 提示存在一个ABX耦合系统的苯环，δH 6.94(2H, d, J = 8.3 Hz) 和6.64 (2H, d, J = 8.3 Hz) 提示存在一个AA'BB'耦合系统的苯环.高场区除了给出了一个甲氧基取代基δH 3.72 (3H,s) 之外，还给出了若干脂肪链上质子.与文献[13-14]对照基本一致，因此鉴定化合物4为1-(4'-羟基苯基)-7-(3''-甲氧基-4''-羟基苯基)-庚烷-3-醇[1-(4'-hydorxyphenyl)-7-(3''-methoxy-4''- hydorxyphenyl)-hepta -3-ol].

化合物(5)为黄色油状物，难溶于水，易溶于有机溶剂.盐酸镁粉反应显色呈橙红色，推断可能为酮类化合物.根据GC-MS所得数据，推测分子质量为160.在1H-NMR(DMSO-d6,500 MHz)中，δH 7.07 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz),δH7.25 (1H, dd, J = 8.0 Hz),δH7.32 (1H, dd, J = 2.0 Hz)提示存在一个1,3,4取代的苯环；在δH 9.89有一个活泼氢信号，判断为苯环上的酚羟基；δH 2.12～2.15(2H, m)，判断其为3位上的两个质子；在δH 5.10(1H, dd, J = 8.7, 4.0 Hz)，为B环上的4位上的质子；在δH 5.29有一个活泼氢，为B环上连接的酚羟基；在δH 2.43与δH 2.91各有一个氢信号，确定其为B环上的2位上的氢信号.查阅相关文献[15]，综合以上信息推断化合物5为4,6-二羟基-3,4-二氢-1-萘酮(4,6-dihydroxy-3,4-dihydro-naphthalenone).

化合物(6)为橙黄色针状晶体，mp158～159 ℃，不溶于冷水，微溶于热水，溶于乙醇、乙醚，与氯仿、苯混溶.无色亚甲蓝溶液薄层显色呈蓝色，示可能为醌类化合物.产生的1H-NMR数据δH 11.9的单峰为羟基中质子的吸收，δH 7.65～7.68附近的组峰为萘醌环C7-H、C8-H两个质子的吸收，δH 7.28～7.32附近的组峰是萘醌环上C6-H质子的吸收，δH 6.96-6.99附近的组峰是萘醌环上C2-H、C3-H两个质子的吸收，与文献值中胡桃醌一致[16]，薄层色谱与胡桃醌标准品的Rf值一致，HPLC检视与胡桃醌对照品的保留时间一致.综合以上信息推断化合物6为5-羟基-1,4-萘醌(5-hydroxy-1,4-naphthoquinone)即胡桃醌.

化合物(7)为白色针状晶体，易溶于有机溶剂.薄层色谱用硫酸乙醇显色剂显色为紫红色.Liberman-Burchard反应呈阳性，表明此化合物是甾体或三萜.mp139-141 ℃.ESI-MS(m/z)；415.4[M+H]+，437. 7[M+Na]+，推测分子质量为414，1H-NMR(CDCl3-d,500 MHz)，在δH 0.6-1.2之间有6个甲基氢信号，符合β-谷甾醇中甲基峰数.δH 0.67(3H, s)，1.02 (3H, s)，分别对应18、19位的角甲基质子.δH 0.83 (3H, d, J = 6.8 Hz)，0.84(3H, t, J = 7.3 Hz)，0.87 (3H, d，J=6.8 Hz)，0.92 (3H, d, J = 6.3 Hz)，分别对应27、29、26、21位的甲基质子信号，δH 3.53 (1H, m) 处可见一连氧碳氢信号，应为3-H信号.δH 5.35 (IH, d, J = 5.2 Hz)为一双键上质子信号，证明结构中有1个双键，同时说明双键另一端碳应为季碳，化合物的理化性质和光谱数据与文献[8,17-19]报道基本一致.因此鉴定化合物7为β-谷甾醇(beta-sitosterol).

化合物(8)为白色针晶(乙醇中重结晶)；Liebermann-Burchard反应显紫红色，表明为三萜或甾体类，可溶于有机溶剂，难溶于水.ESI-MS(m/z)；456.8 [M+]，481.1[M+Na+H]+，表明分子质量为456.1H-NMR谱中 (CDCl3-d,500 MHz) 谱中δH 1.14 (3H,s)，0.97 (3H,s)，0.93 (3H,s)，0.91 (3H,s)，0.87 (3H,s)，0.79 (3H,s)，0.75 (3H,s)这7个单峰对应骨架上的7个角甲基.δH 4.30 (1H, d, J = 4.6 Hz, OH-3)， 5.29 (1H, t, J = 3.0 Hz, 12-H), 3.21 (1H, dd, J = 11.0, 4.4 Hz, 3-H), 2.83 (1H, dd, J = 9.6, 2.5 Hz, 18-H) 分别对应C12-H、C3-H和C18-H.光谱数据与文献[20-21]报道一致，确定化合物8为齐墩果酸(oleanolic acid).

化合物(9)为白色晶体，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，表明有酚羟基的存在，溴酚蓝反应阳性，表明有羧基的存在ESI-MS(m/z)：169.0[M+H]+，191.1[M+Na]+，215.8[M+2Na+H]，表明分子质量为168.在1H-NMR谱中(CDCl3-d,500 MHz)在芳香区可见一组耦合系统，三个质子δH 6.87 (1H, d, J = 8.6 Hz)，7.09 (1H, d, J = 8.6 Hz)，7.95 (1H, s, H-2)说明存在ABX耦合的三取代苯环系统，δH 12.11 (1H,s)为羧基质子，δH 3.98 (1H,s) 处为一个甲氧基质子，δH 9.89 (1H,s) 为酚羟基质子，Emerson反应阴性提示羟基的对位有取代基，其波谱数据信息与文献中香草酸的数据[22]对照基本一致，故鉴定化合物9为3-甲氧基-4-羟基苯甲酸，即香草酸(vanillic acid).

化合物(10)为黄色针状结晶(氯仿-甲醇)，三氯化铁-铁氰化钾反应呈阳性，HCl-Mg反应呈阳性，显示该化合物为多羟基取代黄酮类化合物.ESI-MS(m/z)：303.1[M+H]+，325.1[M+Na]+，348.4[M+2Na]，表明分子质量为302.1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) 谱中：δH 6.25 (1H, d, J = 1.6 Hz), 6.40 (1H, d, J = 1.6 Hz)为典型的5，7-二氧取代黄酮A环6、8位的质子信号；δH 7.67 (1H,s), 7.54(1H, d, J = 8.5 Hz), 6.88 (1H, d, J = 8.5 Hz)为黄酮B环2'位、6'位、5'位的质子信号，表示B环为3',4'-二氧取代，低场区δH 12.47、9.35、9.35为3个活泼质子信号，结合化学位移分别归属为5位、3'位和4'位羟基.δH 10.7 (1H,s) 为A环7位羟基质子信号，9.33 (1H, s) A环3位羟基质子信号，1H-NMR谱数据与文献[23]报道的槲皮素相符.经与己知槲皮素对照品进行共薄层检测，以3种溶剂系统展开Rf值均一致，且显色过程完全相同，故鉴定该化合物为槲皮素(quercetin).

化合物(11)为无色晶体，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，表明有酚羟基的存在，ESI-MS(m/z)：153.1[M+H]+，176.3[M+Na]+，199.0[M+2Na]，表明分子质量为152.在1H-NMR谱中(CDCl3-d,500 MHz)在芳香区可见一组耦合系统，三个质子δH 7.11 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 7.31 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6)，7.61 (1H, s, H-2) 说明存在ABX耦合的三取代苯环系统，δH 3.61 (1H, s)处为一个甲氧基质子，δH 9.71 (1H, s) 为一醛基质子，Emerson反应阴性提示羟基的对位有取代基，其波谱数据信息与文献中香草醛的数据[24-25]对照基本一致，故鉴定化合物11为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，即香草醛(vanillin).

青龙衣中提取的11种化合物对5株肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)见表1.化合物(5)和化合物(6)的抗肿瘤活性较强，对肿瘤细胞有很强的生长抑制作用.化合物(10)对肿瘤细胞有较强的生长抑制作用.化合物(4)对A549和MCF7的生长抑制作用较明显；化合物(2)对SGC7901，HepG-2，MCF7有较为显著的生长抑制作用；化合物(8)对MCF7细胞有一定的生长抑制作用；化合物(9)对A549细胞有一定的生长抑制作用，但是对其它细胞的生长抑制作用不明显.化合物(1)、化合物(3)、化合物(7)和化合物(11)对肿瘤细胞没有生长抑制作用.

表1MTT实验中化合物1-11的IC50

No.IC50/(μmol·L-1)SGC7901HepG-2 A549MCF7LoVo12.30×106±0.78×1043.88×109±1.29×1072.53×104±×1021.27×102±2.36266.12±0.5980.90±0.8229.74±0.131.25×107±2.26×10532.49×105±0.54×1032.26×107±0.83×1052.09×1010±4.51×1085.70×104±3.49×10242.49×102±4.281.49×102±3.8156.05±2.4133.82±1.79528.14±0.8123.89±0.4322.42±0.7720.51±0.98621.20±0.5634.70±0.9124.80±0.6525.47±0.6777.48×1021±3.56×10201.50×109±3.95×1071.25×108±3.28×1061.12×107±2.94×1053.29×105±1.66×1038114.44±3.02117.60±3.10154.52±4.0794.89±2.5092.00×103±10.501.43×103±13.9093.5±0.641.16×102±0.761053.61±1.4147.81±1.2657.16±1.5154.56±1.44114.68×105±3.24×1031.94×106±1.30×1041.36×108±1.19×10612.54×104±10.47×1028.23×104±10.64HCPT50.74±1.3450.25±1.3239.42±1.0440.34±1.0644.12±1.51

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