山东省克氏原螯虾3个地理群体遗传差异的RAPD分析

张龙岗，杨玲，刘羽清 董学飒，朱永安，付佩胜 （山东省淡水渔业研究院，山东省淡水水产遗传育种重点实验室，山东 济南 250117）

克氏原螯虾 （Procambarus clarkii）隶属螯虾科原螯虾属，是淡水螯虾的一个种，俗称淡水小龙虾［1］。克氏原螯虾原产于美国南部和墨西哥北部，20世纪30年代末由日本引入到中国。克氏原螯虾肉味鲜美，高蛋白质低脂肪，钙、磷、铁质含量丰富。自1983年中国科学院动物研究所戴爱云研究员首次提倡开发利用淡水螯虾以来，克氏原螯虾已成为我国重要的水产资源，现已广泛分布于我国东部和中部地区十余个省市，甚至已成为一些湖泊和沟渠的优势种群［2］。

Barbaresi等［3］利用随机扩增多态性DNA标记 （RAPD）对欧洲5个克氏原螯虾群体进行了遗传变异分析，结果显示5个群体具有高度的遗传变异，揭示了引入的克氏原螯虾群体来源于不同的地域。Barbaresi等［4］利用线粒体DNA测序技术和微卫星技术对西欧和北美的12个克氏原鳌虾群体进行了分析，探明了克氏原螯虾在西欧的迁移路线。目前，国内学者对克氏原螯虾的群体遗传学研究也已开展，Yue等［5］利用mtDNACOI序列和5个微卫星位点探讨了江苏南京和浙江桐乡克氏原螯虾群体的遗传结构；刘炜［6］利用7个微卫星位点探讨了东部地区6个克氏原螯虾群体的遗传多样性及各群体间的亲缘关系。王长忠等［7］利用17个微卫星标记对长江下游地区4个克氏原螯虾群体进行了遗传多样性研究。本研究利用12对RAPD引物对山东地区3个克氏原螯虾地理群体的遗传差异状况及遗传结构进行了本底调查，以期为有针对性地开展克氏原螯虾资源保护和遗传育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

克氏原螯虾野生群体样本于2012年4～6月分别采自于山东微山湖 （WS）、东平湖 （DP）以及济南小清河 （JN），每个群体样本数量均为30尾。

1.2 基因组DNA的提取

取100mg样品低温下剪碎并研磨为糊状，采用生工生物工程 （上海）股份有限公司的UNIQ－10柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取总DNA，并用1.0%的琼脂糖电泳检测纯度，－20℃冰箱保存备用。

1.3 PCR扩增

在生工生物工程 （上海）股份有限公司合成200条随机引物，用于PCR扩增。PCR总反应体积为25μl，反应体系为：10×buffer 2.5μl，25mmol／L 的 MgCl22μl，2.5mmol／L 的 dNTP 2μl，引 物（10μm／L）为1μl，DNA模板1μl，Taq酶 （TaKaRa，5U／μl）0.2μl，其余由灭菌双蒸水补足至终体积。扩增程序为：94℃预变性2min，然后进行35个循环 （94℃1min，36℃1min，72℃1min），72℃延伸5min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳法检测，凝胶成相系统观察、照相。

1.4 数据处理

根据观察结果，记录清晰、明亮且重复性好的条带。将相同迁移距离的条带看作同一位点，统计总条带数，多态性条带数。根据RAPD产物的电泳带型，在相同的迁移率上，出现带的记为1，没有出现带的记为0。构建原始数据库矩阵，并据此统计位点总数和多态位点比例，采用NTsys－pc 2.02软件进行遗传相似性系数和遗传距离的分析，并进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA抽提结果

经1.0%的琼脂糖凝胶检测，可以看出DNA模板比较纯净单一，没有杂带出现，条带清晰，浓度和纯度基本符合RAPD扩增要求。

2.2 RAPD扩增结果

本研究使用200条随机引物对取自济南小清河、微山湖和东平湖3个不同地理群体的30只克氏原螯虾进行RAPD分析。按照条带清晰且多态性丰富、重复性好、条带数量适中的原则，共挑选出12个随机引物 （表1）。12个随机引物共扩增出118个位点（平均每条引物产生8～12个位点），其片段大小为200～2000bp，其中多态位点共计48个 （多态片段的比例为40.68% ）。

图1 制备的克氏原螯虾DNA凝胶成像图

表1 筛选出的12个随机引物序列及其扩增的条带数

2.3 群体内与群体间的遗传相似系数及遗传距离

通过统计各群体30只个体间共有的RAPDs，计算得群体间的遗传相似系数和遗传距离。表2表明，群体内的遗传相似系数 （0.9023～0.9411）明显大于群体间的遗传相似系数 （0.6845～0.7973），说明群体间的遗传差异要大于群体内的遗传差异。与其他群体相比，微山群体内的遗传变异程度较大，其次是东平群体，济南小清河群体内的变异度最小。微山湖和东平湖群体间的遗传相似系数最高 （0.7973），遗传距离最小 （0.2027），说明这2个群体的亲缘关系最近。济南小清河和微山湖群体间的遗传相似系数最小 （0.6845），遗传距离最高 （0.3155），说明2个群体的亲缘关系较远。

2.4 群体聚类分析

基于Nei′s遗传距离对3个克氏原螯虾群体构建UPGMA聚类树 （图2）。表明，微山湖群体与东平湖群体聚为一支，济南小清河群体单独聚为一支。

表2 3个地理群体的遗传相似系数及群体间的遗传距离

3 讨论

克氏原螯虾遗传多样性的研究不仅对于野生物种的遗传资源的保护及苗种的选育具有重要的意义［8］，而对不同地理群体的特性及相互间差异的了解则是遗传育种的基础［9］。本研究利用RAPD标记技术研究了山东省克氏原螯虾3个地理群体 （微山湖、东平湖、济南小清河）的遗传多样性，结果表明，济南小清河群体的遗传多样性最低，其次是东平湖群体，微山湖群体的遗传变异最大。本研究没有找出区分克氏原螯虾3个地理群体的特征性条带，很可能是所筛选的引物还不足以找出这样的特征带，对此还有必要进一步探讨。

遗传相似系数是衡量群体遗传变异程度的可靠参数，群体间的亲缘关系越近则遗传变异性就越低，相似系数值就越大［10］。济南小清河群体内的遗传相似系数 （0.9411）要高于微山湖 （0.9023）和东平湖群体 （0.9325），说明其群体内个体间的差异较小，纯度较高，遗传多样性偏低，也反映出近年来济南小清河群体因酷渔滥捕对其群体资源的影响较大，造成其群体内多态性有所下降，可利用的遗传变异减少。

遗传距离是反映群体遗传变异程度的尺度，常常用来分析群体间的亲缘关系和遗传变异程度，遗传距离越大表明群体间亲缘关系就越远。济南小清河和微山湖群体间的遗传距离最高 （0.3155），说明2个群体的亲缘关系较远。基于Nei′s遗传距离对3个克氏原螯虾群体构建的UPGMA聚类树也表明，微山湖群体与东平湖群体亲缘关系较近，与济南小清河群体亲缘关系较远。分析可能是因为随着近年来小龙虾产业的蓬勃发展，尤其微山湖和东平湖一带小龙虾养殖业发展较快，每年都有大量来自长江流域的小龙虾苗种引入，人为因素的介入使得微山湖群体与东平湖群体与外界存在着频繁的基因交流。而济南小清河群体环境相对封闭，与其他群体缺乏基因交流，与其他群体的亲缘关系较远，而独立成组。

目前，对于克氏原螯虾功能基因方面的信息了解还不多，下一步需对克氏原螯虾多态性序列进行大批量的测序分析，最终将其定位在某条染色体或某个功能基因上，通过基因工程的方法，培育出具有优良性状的品种，以促进克氏原螯虾养殖业快速发展。

图2 UPGMA聚类分析法构建的3个群体克氏原螯虾的分子系统树

［1］沈嘉瑞.我国的虾类 ［M］.北京：科学出版社，1976.

［2］王卫民.软壳克氏原螯虾在我国开发利用前景 ［J］.水生生物学报，1999，23（4）：375－381.

［3］Barbaresi S，Fani R，Gherardi F，et al.Genetic variability in European populations of aninvasive American crayfish：preliminary results［J］.Biological Invasions，2003，5：269－274.

［4］Barbaresi S，Fani R，Gherardi F，et al.Genetics and invasion biology in fresh waters：apilot study of Procambarus clarkii in Europe［J］.Biological Invaders in Inland Waters：Profiles Distribution and Threats，2007，4：381－400.

［5］YUE G H，WANG G L，ZHU B Q，et al.Discovery of four natural clones in a crayfish species Procambarus clarkii ［J］.International Journal of Biological Sciences，2008，4：279－282.

［6］刘炜.克氏原螯虾肌肉肌苷酸含量及遗传多样性研究 ［D］.扬州：扬州大学，2008.

［7］王长忠，李忠，梁宏伟，等.长江下游地区4个克氏原螯虾群体的遗传多样性分析 ［J］.生物多样性，2009，17（5）：518－523.

［8］黄羽.鄱阳湖流域克氏原螯虾的资源状况及长江中下游克氏原螯虾遗传多样性研究 ［D］南昌：南昌大学，2012.

［9］张玮.克氏原螯虾4个地理群体遗传差异的RAPD分析 ［J］.安徽农业科学，2010，38（22）：11861－11862，11876.

［10］Plosky Y，Cahner A，Haberfeld A.DNA Fingerprint bands applied to linkage analysis with quantitative trait loci in chickens［J］.Animal Genetics，1993，24：105－110.