舒林酸对人胰腺癌细胞PANC-1增殖和凋亡的影响及机制探讨

卞保祥，宋子琰，熊光苏

（1.徐州医学院附属连云港医院肿瘤内科，江苏连云港222002；2.上海交通大学临床内科，上海200240）

舒林酸对人胰腺癌细胞PANC-1增殖和凋亡的影响及机制探讨

卞保祥1，宋子琰1，熊光苏2

（1.徐州医学院附属连云港医院肿瘤内科，江苏连云港222002；2.上海交通大学临床内科，上海200240）

目的以人胰腺癌细胞系PANC-1为研究对象，利用不同浓度舒林酸处理PANC-1细胞，观察其对PANC-1细胞增殖、凋亡影响，并探讨舒林酸通过抑制Wnt/β-catenin信号通路杀伤PANC-1细胞的可能机制。方法实验分为阴性对照组(加入不含舒林酸的DMSO）和实验组(分别加入舒林酸浓度为0.25、0.5、1、1.5、2mM的培养液，分别为：阴性对照组、0.25mM组、0.5mM组、1.0 mM组、1.5mM组、2.0mM组，总计6组）。MTT法检测PANC-1细胞生长抑制率；流式细胞术检测细胞凋亡率；RT-PCR和免疫细胞化学技术检测细胞内β-Catenin的表达。结果MTT结果显示：PANC-1细胞经舒林酸干预后生长均受到不同程度抑制，且随着舒林酸浓度增加，抑制作用越强。流式细胞术检测凋亡结果显示PANC-1细胞早期凋亡率干预后均有不同程度增加，与对照组相比，0.5、1.0mM组早期凋亡率差异无统计学意义，而1.5、2.0mM组差异均有统计学意义(P＜0.05）。RT-PCR结果显示可见各组β-catenin mRNA表达量随着舒林酸浓度增加而降低，0.5、1.0mM组与对照组相比差异无统计学意义，而1.5及2.0mM组差异有统计学意义(P＜0.05）；应用2.0mM的舒林酸处理PANC-1细胞0、12、24、48、72 h，随着处理时间延长，β-catenin mRNA表达量逐渐降低，各处理组与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05）。ICC结果证实干预后PANC-1细胞内β-catenin表达量及核聚集降低，与对照组相比，0.25、0.5mM组差异无统计学意义，而1.0、1.5、2.0mM组差异有统计学意义(P＜0.05）。结论舒林酸对PANC-1细胞具有生长抑制及促凋亡作用，这种作用具有浓度-时间依赖性，舒林酸抑制Wnt/β-catenin信号通路可能是其杀伤PANC-1细胞的可能机制之一。

舒林酸；人胰腺癌细胞PANC-1；Wnt/β-catenin信号通路；增殖及凋亡

胰腺癌（pancreatic carcinoma）是一类常见的消化系肿瘤［1］，40岁以上好发，男性比女性多见［2］，近年来随着经济社会的发展，生活条件的改善和人口老龄化，其发病率逐年升高，死亡率几乎等同于发病率，5年生存率仅1%～3%，患者长期生存情况较差［3］。世界上每年因胰腺癌而导致死亡的人数大约为25万，其发病率在所有恶性肿瘤中排13位，病死率在所有恶性肿瘤中居首位，约为98%，大多数病人发病时已处于晚期，主要治疗方法包括手术、化疗、放射性粒子植入、对症支持治疗等［4-5］。本研究旨在通过对胰腺癌细胞系PANC-1中的β-catenin进行检测，并利用非甾体抗炎药舒林酸对其干预，探讨其对PANC-1的Wnt/β-catenin信号途径及增殖、凋亡的影响，探讨非甾体抗炎药在胰腺癌的预防及治疗中的可能价值。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 舒林酸（sulindac）购于美国Enzo公司（product No：430105G001）；人胰腺癌细胞株PANC-1购于中国科学院典型培养物委员会细胞库（上海）；兔抗人β-catenin多克隆抗体购买于Santa Cruz公司；生物素化羊抗兔单克隆IgG抗体、免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒购于武汉天兴生物科技有限公司；MTT试剂盒、Annexin-V/FITC凋亡检测试剂盒购于江苏碧云天生物科技有限公司；细胞裂解液Trizol购于美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒购买于美国Fermentas公司；PCR反应引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；DMEM高糖培养基购于浙江吉诺生物医药技术有限公司；新生胎牛血清购于美国Hyclone公司；DMSO、EDTA购于美国Sigma公司；2.5%胰蛋白酶购于杭州吉诺生物医药技术有限公司；无水乙醇、碳酸氢钠购于武汉科瑞生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 MTT法检测舒林酸对PANC-1的生长增殖情况影响：用DMEM高糖培养液（含10%新生胎牛血清）将生长状况良好的PANC-1细胞配成单细胞悬液，以每孔约103个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL，分为6组，每组设5个复孔。最外一圈加入约150μL无菌PBS防止培养基蒸发。共4块培养板，分别编号为A、B、C、D。细胞在5%CO2，37℃环境下培养至细胞单层铺满孔底，加入无血清培养基，分别加入含0.25、0.5、1、1.5、2 mM的舒林酸进行共培养。分别孵育0、24、48、72 h，实验结束前4 h每孔加入0.5%MTT溶液20μL，继续共培养4 h，倒置显微镜下观察到紫色结晶后，用巴氏吸管小心吸去上清液，每孔加入150μL DMSO，置摇床上低速震荡15min，使结晶物充分溶解，在酶联吸附仪OD490 nm处检测各孔吸光度值（OD值）。重复3次实验，以作用时间为横坐标，PANC-1细胞抑制率为纵坐标绘制曲线，按公式：抑制率=1-实验组OD值/对照组OD值×100%计算细胞抑制率。

1.2.2 Annexin-V/FITC双染法检测舒林酸对人胰腺癌细胞PANC-1的细胞凋亡影响：①取生长状况良好，经台盼蓝染色，成活细胞在98%以上的对数生长期人胰腺癌PANC-1细胞作为实验细胞。悬浮对数生长期的人胰腺癌PANC-1细胞用血球计数板计数，调整细胞悬液密度为1.0×105个/mL。接种于6孔板中，培养6 h待其贴壁后分为3组：阴性对照组（加入不含舒林酸的培养液）、空白对照组（不不加Annexin V-FITC及PI）和实验组（分别加入舒林酸浓度为0.25、0.5、1、1.5、2 mM的培养基），继续培养48 h。②参照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。把细胞培养液吸出至合适的离心管内，PBS冲洗PANC-1细胞一次，加入适量胰蛋白酶液消化，加入上述细胞培养液，混匀并用巴氏吸管吹打成为单细胞悬液，转移至离心管内，1 000 r/min离心5min，弃上清，加入195μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。③加入5μl Annexin V-FITC至悬浮液中，轻轻混匀，避光孵育15min。④向上述悬浮液中加入10μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置，随即300目滤网过滤，1 h内上机检测，上述操作均为同步处理。⑤凋亡十字图左下象限代表正常活细胞，右下象限代表早期凋亡细胞，右上象限代表晚期凋亡和坏死细胞，左上象限代表实验许可范围内的检测误差。

1.2.3 免疫细胞化学检测舒林酸对人胰腺癌PANC-1细胞β-catenin蛋白影响：①悬浮生长状况良好的对数生长期的人胰腺癌PANC-1细胞并计数，调整细胞悬液密度为1.0×105个/ mL。接种于6孔板中（底部铺无菌载玻片），培养6 h待其贴壁后分为2组：阴性对照组（加入不含舒林酸的DMSO）和实验组（分别加入舒林酸浓度为0.25、0.5、1、1.5、2 mM的培养液），继续培养24、48 h；②收获细胞，并将爬片用4%多聚甲醛固定15 min后晾干；③水化：将玻片依次置于95%、80%、75%无水乙醇中各5min，然后蒸馏水中漂洗5min；④灭活内源性过氧化物酶：将新鲜配置的3%H2O2100μL滴加在玻片上，37℃湿盒孵育15 min，PBS漂洗5min×2次；⑤抗原修复：置于0.01mM枸橼酸缓冲液中，微波修复10 min，室温自然冷却后PBS漂洗5 min×3次；⑥封闭非特异性抗原：用10%牛血清蛋白封闭60min后甩去多余液体，不洗；⑦镜下观察染色情况，并拍照；⑧在400倍显微镜下观察细胞爬片，按“米”字形随机选择5个视野，计算每个视野内的肿瘤细胞，以胞浆和胞核着色判断阳性，根据阳性细胞数和着色强度进行半定量评分：无阳性0分，阳性细胞1%～30%为1分，31%～70%为2分，71%～100%为3分，然后根据着色强度依次计0、1、2、3分，每张爬片2项累计，0分为阴性（-），1、2分为弱阳性（+），3、4分为阳性（++），5、6分为强阳性（+++）。

2 结果

2.1 舒林酸对人胰腺癌细胞PANC-1增殖影响 MTT结果显示：分别用0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mM的舒林酸干预24、48、72 h后，PANC-1细胞生长均受到不同程度抑制，随浓度升高，抑制作用越强；实验组间对比，1.5mM和2.0mM组在48 h、72 h时抑制率差异无统计学意义。随着药物干预时间延长，48 h后抑制率上升不如48 h前上升明显（见表1）。

表1 舒林酸作用PANC-1细胞后A490均值及抑制率（n=3）Tab.1 A490 mean and inhibition rate of sulindac on PANC-1 cells（n=3）

2.2 舒林酸对人胰腺癌细胞PANC-1的凋亡影响Annexin V-FITC双染法凋亡检测显示，应用0、0.5、1.0、1.5、2.0 mM舒林酸处理48 h，PANC-1细胞早期凋亡率均有不同程度增加，其中0.5、1.0mM组早期凋亡率与对照组相比，差异无统计学意义，1.5、2.0mM组与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表2 不同浓度舒林酸对人胰腺癌细胞PANC-1细胞凋亡影响（n=3）Tab.2 Effects of different concentrations of Sulindac on apoptosis of human pancreatic cancer cell line PANC-1 cells（n=3）

图1 不同浓度舒林酸处理PANC-1细胞24 h后检测凋亡十字象限图Fig.1 Detection of apoptosis in cross quadrant of different concentrations of sulindac treated PANC-1 cells by 24 h

由图可知，随着舒林酸浓度的上升，早期凋亡率不断增加，1.5组及2.0mM组早期凋亡增加较明显（25.34%、30.31%），与阴性对照组相比（7.15%）差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 舒林酸对人胰腺癌细胞PANC-1内β-Catenin的mRNA表达影响 应用不同浓度舒林酸处理人胰腺癌细胞系PANC-1，RT-PCR结果显示：分别应用0、0.5、1.0、1.5、2.0mM的舒林酸处理PANC-1细胞24 h后，可见各组β-catenin mRNA表达量随着舒林酸浓度增加而降低，0.5mM组、1.0mM组与对照组相比，差异无统计学意义，但1.5mM组及2.0mM组差异有统计学意义（P＜0.05）；应用2.0mM的舒林酸处理PANC-1细胞0、12、24、48、72 h，随着处理时间延长，β-Catenin mRNA表达量逐渐降低，各处理组与对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05，见图2）。

图2 RT-PCR检测舒林酸对β-CateninmRNA表达影响Fig.2 Effect of RT-PCR detection of Sulindac on the expression ofmRNA beta-Catenin

2.4 舒林酸对人胰腺癌细胞PANC-1内β-catenin蛋白表达及分布影响 免疫细胞化学结果显示：在正常胰腺癌细胞PANC-1中，β-catenin在胞浆和胞核中都有表达，分别利用0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mM的舒林酸处理PANC-1细胞24、48 h，染色后对细胞爬片进行ICC评分（见表3），对照组β-catenin阳性及强阳性率为76.1%，1 mM组为56.2%，2 mM组为5.0%，与对照组相比，0.25、0.5 mM组差异无统计学意义，但1.0、1.5、2.0mM组差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 不同浓度舒林酸对人胰腺癌细胞PANC-1细胞β-catenin表达影响（n=3）Tab.3 Effects of different concentrations of Sulindac on human pancreatic carcinoma cell PANC-1 cell catenin（n=3）

随着舒林酸干预浓度增加及时间延长，可见β-Catenin蛋白表达逐渐降低，伴随胞核表达逐渐降低，1.5mM干预48 h及2.0 mM干预24、48 h后β-Catenin蛋白胞浆阳性表达基本消失，且未见核聚集，认为舒林酸对β-Catenin蛋白表达有抑制作用，染色结果见图3，其中实心箭头表示胞核表达，空心箭头表示胞浆表达。

图3 不同浓度舒林酸干预不同时间β-Catenin蛋白表达情况（DAB，×400）Fig.3 Different concentrations of sulindac intervention at different time on β-Catenin protein expression（DAB，×400）

3 讨论

胰腺癌是恶性程度较高的消化系统肿瘤之一［6-7］，其病因多样，病情较复杂，治疗较困难，是高致死率肿瘤之一。虽近年手术切除率较以前有所提高，围手术期死亡率及合并症发生率较以前有明显下降，但治疗效果仍无显著改善，五年生存率仍低于5%。近年来胰腺癌的基础与临床研究逐渐增加，尤其是在干细胞学说、星状细胞与胰腺癌的关系、小干扰RNA及胰腺癌动物模型方面对胰腺癌的发病原因、肿瘤发生机制及侵袭、转移机制等方面取得了一定进展，而Wnt信号通路与胰腺癌的关系近年也被逐渐认识。最近Mook RA等［8］报道结肠癌转移通常与Wnt/β-Catenin的异常激活和S100A4表达相关，S100A4是β-catenin的下游转录激活基因之一，他们利用舒林酸处理不同结肠癌细胞系，能降低β-catenin的浓度及核聚集，同时在动物试验中证实舒林酸能降低肿瘤的转移，与β-catenin降低及S100A4减少有关。他们认为舒林酸能调节β-catenin信号具有抗肿瘤细胞转移的潜质。

本研究分别用不同浓度舒林酸干预PANC-1细胞24、48、72 h，发现细胞生长均受到不同程度抑制，且随着浓度升高，抑制作用越强。凋亡实验显示：应用不同浓度的舒林酸处理PANC-1细胞24 h，细胞早期凋亡率均有不同程度增加，0.5、1.0mM组早期凋亡率与对照组相比，差异无统计学意义，而1.5及2.0mM组与阴性对照相比，差异有统计学意义（P＜0.05），说明药物浓度均在1.5及2.0mM具有较明显的生长抑制及凋亡诱导作用。利用RT-PCR及免疫细胞化研究舒林酸对β-catenin表达影响发现，β-cateninmRNA及蛋白表达均受抑制，随着时间延长，βcateninmRNA表达量逐渐降低，在1.5及2.0mM组差异较明显，免疫细胞化发现随着药物浓度计作用时间延长，β-Catenin蛋白阳性表达逐渐降低，伴随胞核表达逐渐降低，1.5 mM干预48 h及2.0mM干预24、48 h后β-Catenin蛋白胞浆阳性表达基本消失，且未见核聚集，认为舒林酸对β-Catenin蛋白表达有抑制作用。

［1］ Herr P，Hausmann G，Basler K.WNT secretion and signaling in human disease［J］.Trends Mol Med，2012，18(8）：483-493.

［2］Anastas JN，Moon RT.WNT signaling pathways as therapeutic targets in cancer［J］.Nat Rev Cancer，2013，13(1）：11-26.

［3］Cudney SM，Vieira AR.Molecular factors resulting in tooth agenesis and contemporary approaches for regeneration：a review［J］.Eur Arch Paediatr Dent，2012，13(6）：297-304.

［4］Moravec M.Colorectal cancer and canonicalWnt signaling pathway［J］. Cas Lek Cesk，2012，151(7）：335-421.

［5］Ellies DL，Viviano B，McCarthy J，et al.Bone density ligand，Sclerostin，directly interacts with LRP5 but not LRP5G171V to modulate Wnt activity［J］.J Bone Miner Res，2006，21(11）：1738-1749.

［6］Harter ink M，Korswagen HC.Dissecting the Wnt secretion pathway：key questions on themodificat ion and intracellular trafficking of Wnt proteins［J］.Acta Physiol，2012，204：8-16.

［7］White BD，Chien AJ，Dawson DW.Dysregulation of Wnt/β-catenin signaling in gastrointestinal cancers［J］.Gastroenterology，2012，142 (2）：219-232.

［8］Mook RA，Chen M，Lu J，et al.Smallmolecule modulators of Wnt/βcatenin signaling［J］.Bioorq Med Chem Lett，2013，13：134-140.

（编校：吴茜）

Effect of sulindac on human pancreatic cancer cell PANC-1 proliferation and apoptosis and its possiblemechanism

BIAN Bao-xiang1，SONG Zi-yan1，XIONG Guang-su2

（1.Department of Medicine-Oncology，Lianyungang Hospital Affiliated to Xuzhou Medical College，Lianyungang 222002，China；2.Department of Clinical Internal Medicine，Shanghai JiaoTong University，Shanghai200240，China）

ObjectiveTo discuss the influence of different concentration sulindac on pancreatic cancer cell line PANC-1 cell proliferation and apoptosis，and investigate the possible mechanism that sulindac can inhibit the Wnt/beta-catenin pathway to kill pancreatic cancer cells.MethodsPANC-1 cellwere divided into negative control group（added containing no sulindac DMSO）and experimental group（added sulindac with concentrations of 0.25，0.5，1，1.5，2mM medium，respectively，name as 0.25mM group，0.5mM group，1.0mM group，1.5mM group，2.0mM group），and treated with different time，cell proliferation inhibition ratio in each group was detected by MTT assay，cell apoptosis ratiowas detected by flow cytometry，the expression ofβ-catenin mRNA and protein were detected by RT-PCR and immunocytochemistry.ResultsMTT results showed that sulindac can inhibit the cell proliferation of PANC-1 by a dose-and time-dependentmanner.Cell apoptosis increased after sulindac treatment in different degrees，and therewere statistical differences between 1.5，2.0mM group and controlgroups（P＜0.05）.RT-PCR results showed that the expression of β-catenin mRNA decreased after the treatmentof sulindac，therewere statistical differences between 1.5，2.0mM group and control group（P＜0.05）. In the 2.0mM group，the expression ofβ-catenin decreased along with the time extending（P＜0.05）.ICC results showed that sulindac inhibited the expression ofβ-catenin protein and nuclear accumulation，there were no statistical differences in 0.25，0.5mM group and control group，but there were statistical differences in 1.0，1.5，2.0mM group.ConclusionSulindac could inhibit cell proliferation and facilitate apoptosis of PANC-1，this effect is dose-and time-dependent.The inhibition ofWnt/beta-catenin signal pathway may be a possiblemechanism of its cytotoxicity.

sulindac；human pancreatic cancer line PANC-1；Wnt/β-catenin signal pathway；proliferation and apoptosis

卞保祥，男，研究生，副主任医师，研究方向：肿瘤内科综合治疗，E-mail：qch1821460098@163.com。

R735.9

A

1005-1678(2014）07-0023-04

2009年教育部博士点基金项目（20090073120092）