电针对去卵巢大鼠学习记忆及海马乙酰胆碱转移酶的影响

唐 曦 唐成林 刘仁建

(重庆医科大学中医药学院，重庆 400016)

绝经后妇女用雌激素替代治疗可提高绝经后妇女的认知和记忆能力〔1〕。胆碱能系统在中枢神经系统分布广泛，其作用以兴奋为主，广泛影响中枢神经系统功能，其中包括在促进学习和记忆方面所起的重要作用，且与海马的胆碱能系统直接相关〔2〕。 在临床上，针灸对治疗老年妇女认知功能障碍有一定的疗效，但其作用机制尚不清楚。本实验采用卵巢切除大鼠模型，造成低雌激素记忆障碍，观察电针对去卵巢大鼠行为学，体内雌激素水平及海马乙酰胆碱转移酶(CHAT)生成的影响，探讨电针改善绝经后妇女认知功能的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物分组、模型制备 健康雌性SD大鼠40只，3月龄，体重160～200 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号: SCXK(泸)2007-0005。 采用随机数字法将大鼠随机分成假手术组；模型组；电针组；假电针组，每组10只。10%水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)按0.3 ml/100 g，腹腔注射麻醉。假手术组切除卵巢周围(DOX)脂肪，其余各组均实行双侧卵巢切除术。假手术组和模型组术后不予任何处理；电针组切除卵巢2 w后予电针刺激，选穴方法按华兴邦氏的方法实施，选取“足三里”“肾俞”两穴，在不麻醉的状态下采用一次性细美容针刺入穴位，双侧足三里穴接通韩氏电针仪(南京济生医疗科技有限公司)，刺激参数：连续脉冲波，频率3～4 Hz，强度4～5 mA，以使大鼠后肢抖动为宜，在上午9时开始，每次20 min，隔日1次，连续治疗3个月；假电针组针刺操作同电针组，但不接通电针仪。水迷宫测试结束后，将大鼠麻醉,颈总动脉取血，分离血清。在冰面上断头取脑，并迅速分离海马组织，立即将海马组织置液氮中，于-80℃低温冰箱保存，用于组织蛋白和组织mRNA的提取。

1.2Morris水迷宫测试 于造模前后、治疗后进行测试。

1.2.1定位航行试验 历时4 d，每天上下午各2次，将大鼠面向池壁，分别从4个入水点放入池中，记录大鼠寻找到并爬上平台所需时间即为逃避潜伏期时间。

1.2.2空间探索试验 定位航行试验后,去除平台，将大鼠任选一个入水点将大鼠放入池中，测定其在120s内跨越平台位置的次数。

1.3竞争性抑制酶免疫分析法(ELISA) 从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条，密封口袋，放回4℃。空白孔加标本或标准品稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100 μl/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90 min。提前前20 min准备生物素化抗体工作液。 洗板5次。空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100 μl/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60 min。提前前20 min准备酶结合物工作液。避光室温(22℃～25℃)放置。洗板5次。空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100 μl/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30 min。打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。洗板5次。加入显色底物100 μl/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15 min。加入终止液100 μl/孔,混匀后即刻测量450 nm下外直径(OD)值(3 min内)。

1.4Western 印迹 从-80℃低温冰箱中取出大鼠海马组织，加入400 μl裂解液 匀浆后，充分裂解。离心10 min。将上清分装，存于-70℃备检。牛血清白蛋白(BSA)50 mg，加双蒸水到50 ml,配置成终浓度为1 g/L的蛋白标准液。测定并绘制标准曲线，取待测蛋白样品适量，加入考马斯亮蓝G250染液990 ml，测定595 nm OD值，然后在标准曲线上求所得浓度。制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶，将样本用裂解缓冲液稀释相同浓度，取等量上样缓冲液于试管中，蛋白量为70 μg，并于95℃～100℃ 5 min后冰上冷却上样。电泳条件：浓缩胶恒压80 V约30 min，分离胶100 V约90 min。取出凝胶，置于转移缓冲液中平衡15 min。准备滤纸及NC膜，分别置入转移缓冲液及去离子水中。平放底部电极(阳极)，在上面分别放置滤纸、NC膜、凝胶和滤纸，排除各层气泡后将上方电极(阴极)放于夹层物上。按恒流200 mA通电，电转移100 min。PVDF膜在5%脱脂奶粉封闭液中封闭(4℃，过夜)，弃去封闭液，不洗。按约0.1 ml/cm2的量加入封闭液和适量一抗抗体CHAT(1∶400 Santa Cruz)摇床摇荡孵育(4℃，过夜)。PBST漂洗滤膜4次，每次10 min。将膜与HRP结合的二抗(辣根过氧化酶标记抗体)，二抗用封闭液稀释(1∶5 000)室温下摇荡孵育2 h，然后用PBST充分洗膜，漂洗4次，每次10 min。按0.1 ml/cm2显影液计算用量，将显影液加于PVDF膜上，室温放置1 min。用保鲜膜将膜包好(尽量避免气泡)。暗室中迅速将膜蛋白贴在X光胶片上曝光，洗片机中显影、洗像。调整曝光时间，直至出现最佳条带。应用生物凝胶电泳图像分析系统扫描定量， 对各特异性蛋白条带与相应的内参条带进行灰度扫描，以两者比值作为该蛋白合成的相对量。

2 结 果

2.1Morris水迷宫法行为学检测结果 造模前,各组逃避潜伏期时间及跨越平台次数无显著差异(P>0.05)，说明造模前大鼠的认知条件相同；造模后，模型组、假电针组、电针组与造模前比较，大鼠逃避潜伏期时间明显延长，跨越平台次数明显减少(P<0.05)，说明大鼠去卵巢后雌激素水平降低，导致大鼠学习记忆能力减低；电针治疗后，电针组逃避潜伏期时间明显缩短，跨越平台次数明显增加，与治疗前及模型组有显著差异(P<0.05)，与假手术组无显著性差异(P>0.05)。假电针组虽有改善，但仍与假手术组、电针组之间有显著性差异(P<0.05)，说明电针能够提高去卵巢大鼠空间学习记忆能力，逆转记忆损伤。见表1、表2。

2.2电针对去卵巢大鼠血清E2的影响 治疗后3个月，模型组大鼠血清E2水平较假手术组显著下降〔(56.47±6.70) pg/ml,P<0.01〕，电针组血清E2水平较模型组明显上升〔(38.16±5.44) pg/ml,P<0.05〕，但仍未达到假手术组水平〔(65.13±7.72)pg/ml，P<0.01〕，假电针组虽血清E2水平(49.29±5.90)pg/ml较模型组有所上升，但仍与假手术组、电针组之间有显著性差异(P<0.01，P<0.05)。结果表明电针能够提高血清E2的水平。

表1 各组大鼠 Morris 水迷宫逃避潜伏期测试成绩比较

表2 各组大鼠Morris水迷宫跨越平台数测试成绩比较

2.3电针对去卵巢大鼠海马区CHAT蛋白的影响 与假手术组(0.62±0.40)比较，模型组大鼠海马CHAT蛋白表达显著降低(0.33±0.06,P<0.01)，与模型组比较，电针组CHAT蛋白表达显著升高(0.50±0.05，P<0.01)，但仍未达到假手术组水平(P>0.05)。假电针组蛋白表达虽略有升高(0.37±0.42)，但与模型组无显著性差异(P>0.05)。结果表明电针能够上调去卵巢大鼠海马区CHAT蛋白表达。见图1。

图1 各组大鼠海马CHAT蛋白表达

3 讨 论

本实验采用去卵巢大鼠动物模型，造成低雌激素记忆障碍。OVX是一种较好的制备雌激素缺乏模型方法〔3〕。去卵巢大鼠模型不仅有类似绝经妇女雌激素水平的变化和全身多系统衰老的表现，该模型还表现为基底前脑胆碱能系统及海马突触功能降低，而且出现相应的学习记忆功能障碍〔4〕，是一种较好的研究绝经后中枢神经系统退行性变的模型，已被广泛用于观察体内雌激素减少对机体功能活动影响的实验中。Luine〔5〕等研究表明大鼠OVX可使其学习、记忆功能明显下降，并出现海马CHAT 活性明显降低。故本实验采用双侧卵巢切除术制备雌激素缺乏模型，观察海马CHAT蛋白表达水平的变化。

Morris水迷宫测试是目前广泛使用的一种评估啮齿类动物空间学习记忆能力的方法〔6〕。本实验利用 Morris 水迷宫定位航行实验和空间探索实验检测去卵巢大鼠行为学改变及电针对学习记忆的影响。研究结果表明去卵巢大鼠的学习记忆能力明显下降。电针组与假电针组逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增加，且电针组改变更明显。说明从行为学角度评价，电针可改善去卵巢大鼠的学习记忆能力。

大脑海马结构是参与学习记忆的重要神经核团，与学习、记忆密切相关，是记忆储存场所，海马脑区的正常结构是维持动物正常神经行为功能的物质基础，同时也是衰老性变化出现早且最显著的脑区之一，海马结构的损伤可造成学习记忆功能障碍。海马胆碱能系统的兴奋是学习、记忆、意识的基础。大量的研究已经明确证实记忆功能高度依赖于胆碱能系统结构和功能的完整性。Bartus等〔7〕著名的“老年记忆障碍的胆碱能假说”认为脑组织中胆碱能神经元的功能失调在实质上导致了一些老年个体和AD病人认知功能的降低。乙酞胆碱是和学习记忆有关的重要神经递质，海马的胆碱能神经元活动与学习、记忆有密切关系〔8〕。中枢胆碱能系统在学习记忆中起重要作用，海马直接参与信息的贮存和回忆，且予海马胆碱能系统由直接关系〔9〕。以乙酞胆碱为神经递质的中枢胆碱能神经是构成学习记忆的重要生物学基础，其正常功能是学习、记忆的必要条件。胆碱乙酰化转移酶是乙酰胆碱合成的关键酶，是胆碱能神经系统功能变化的重要标记〔10〕。Singh等〔11〕报道，OVX 导致大鼠回避反应减少和空间记忆减退，其大脑皮质和海马对合成 Ach 的原料胆碱的高亲合力摄取减少，CHAT 活性降低。中枢胆碱能系统受神经营养因子和雌激素的双重调节〔12〕，雌激素的长期缺乏影响胆碱能神经元的生长与存活。

本研究观察说明电针能提高体内雌激素水平，并且CHAT蛋白表达受体内雌激素水平变化的影响，提示老年妇女认知功能的减退与体内雌激素水平和海马CHAT蛋白表达降低有关。有研究已表明针刺可维持衰老时脑内乙酞胆碱的含量，并调节胆碱能系统的功能活动〔13〕，改善学习记忆功能。针刺可使老化小鼠胆碱酯酶的活性降低，海马及纹状体内乙酞胆碱含量增加〔14〕。与本研究结果一致。本研究表明，电针对大鼠脑海马CHAT蛋白表达有调整作用，故电针可能通过调节脑内CHAT的表达，促进胆碱能神经元的存活、分化、再生,从而减轻受损脑组织的病理改变,提高雌激素缺乏去卵巢模型大鼠的学习、记忆能力，为电针用于临床治疗痴呆类等中枢神经系统退行性病变提供理论依据。电针影响学习记忆的作用机制是多方面的，这可能和电针使体内雌激素的水平升高从而上调海马CHAT表达有关，也可能和电针对神经内分泌的整体调节有密切关系，电针也可通过影响脑内某些神经递质如内腓肽、P物质NPY等调节雌激素受体的表达〔15〕。因此电针在改善学习记忆功能和治疗老年痴呆症的作用途径亦可能是很复杂的，更深入的作用机制尚需进一步研究。

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