补中益气汤与siRNA对肺腺癌A549/DDP细胞耐药逆转作用的比较

李璐璐 于 丹 王 莹 井 欢 刘春英

(辽宁中医药大学基础医学院病理教研室，辽宁 沈阳 110032)

肺癌常规应用顺铂等化疗药物治疗时，常由于顺铂耐药而影响疗效〔1〕。因此，研究肺癌耐药机制及其逆转途径对治疗具有重要作用〔2〕。研究表明，补中益气汤可对抗化疗引起的胃肠道等不良反应，改善肺癌耐药，提高疗效〔3〕。P-gp蛋白的过度表达是肿瘤产生多药耐药的分子基础，RNA干扰(RNAi)技术通过引起与其同源的mRNA特异性降解，达到抑制相应基因表达的目的。本实验主要观察补中益气汤含药血清对A549/DDP的耐药逆转作用及P-gp表达的影响，探讨该复方药物逆转多药耐药的有关机制。

1 材料与方法

1.1材料 人肺腺癌耐顺铂A549/DDP细胞购自中国科学院肿瘤医院中心细胞库(北京)。SPF级SD 大鼠体重(200±20)g，辽宁中医药大学动物部提供(动物许可证号:2012-0012号)。MTT、DMSO、RPMI1640培养基购于北京鼎国;胎牛血清购于Hyclone;兔抗人P-gp及β-actin购于南京凯基；siRNA由北京鼎国公司设计合成;脂质体转染试剂及反转录试剂均购于北京鼎国公司。电转移仪购于美国Bio-Rad公司，紫外分光光度计(Q-5000)购于Quwell公司，凝胶成像分析仪购于北京市六一仪器厂，双稳数显电泳仪购于北京鼎国生物技术有限公司，荧光定量PCR仪购于ABI公司。

1.2方法

1.2.1制备含药血清 根据《药典》中规定补中益气汤的用药剂量(黄芪18 g，甘草9 g，人参6 g，当归3 g，橘皮6 g，升麻6 g，柴胡6 g，白术9 g)，计算出大鼠等效剂量，以0.576 g/ml常规煎煮。大鼠灌胃给药每日1次，连续3 d。末次给药1 h后，动物麻醉状态下，腹主动脉采血，置无菌管，静置30分后离心，取上清，56 ℃水浴灭活，于超净台上过滤除菌，分装，-20 ℃冰箱冻存备用。

1.2.2细胞培养 将A549/DDP细胞接种在培养瓶中，用含10%胎牛血清培养，放置在含5%CO2，37℃饱和湿度的培养箱中保存。细胞长满贴壁后，胰蛋白酶消化，传代培养。含药血清组在细胞生长至70%时更换含10%补中益气汤含药血清的完全培养基，继续培养24 h后用于后续实验，实验用细胞均处于对数生长期。

1.2.3RNAi 根据siRNA设计原则及P-gp基因在GeneBank中的序列合成3对特异siRNA1、 siRNA2、siRNA3分别对应P-gp mRNA的3个不同部位，用NCBI网站的BLAST序列进行对比，排除同源性。P-gp1F：5′GATCC GCTGGTTGCTGCTTACATATTCAAGAGATATGTAAGCAGCAACCAGCTTTTTTA3′；P-gp1R：5′AGCTTAAAAAAGCTGGTTGCTGCTTACATATCTCTTG AATATGTAAGCAGCAACCAGCG3′；P-gp2F：5′GATCCGCTGCTTACATTCAGGTCATTCAAGAGATGACCTGAATGTAAGCAGCTTT TTTA3′；P-gp2R：5′AGCTTAAAAAAGCTGCTTACATTCAGGTCATCTCTTGAATGACCTGAATGTAAGCAGCG3′；P-gp3F：5′GATC CGGAGATAGGCTGGTGATGTTTCAAGAGAACATCACCAGCCTA TCTCCTTTTTTA3′；P-gp3R：5′AGCTTAAAAAAGGAGATAGGCTGGTGATGTTCTCTTGAAACATCACCAGCCTATCTCCG3′；0F：5′GATCCGCAGATAGGTAGGCGTTATTTCAAGAGAATAACGCCTA CCTATCTGCTTTTTTA3′；0R：5′AGCTTAAAAAAGCAGATAGGTAGGCGTTATTCTCTTGAAATAACGCCTACCTATCTGCG3′。

1.2.4RT-PCR 按照Trizol一步法分别提取各组细胞的总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增出P-gp、内参GAPDH基因片段。P-gp：上游：5'CCACTCCTCCACCTTTGAC3'；下游：5'ACCCTGTTGCTGTAGCCA3'；β-actin：上游：5'CCACTCCTCCACCTTTGAC3'；下游：5'ACCCTGTTGCTGTAGCCA3'，反应结束后，将PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，于紫外透射仪上观察结果，以β-actin为内参照，用反应产物的吸光度与内参的比值表示P-gp基因的表达强度。

1.2.5蛋白免疫印迹试验(Western 印迹) 分别将收集培养的3组细胞提取总蛋白，灌制10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶，常规电泳，转膜，封闭，一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，二抗(1∶2 000)，室温孵育2 h，在暗室用ECL发光，扫描图像后，用Quantity One软件测定各条带的吸光度分析结果，采用所测的p-gp条带与β-actin吸光度值的比值表示该蛋白的表达强度。

1.2.6免疫细胞化学法 取对数生长期的A549/DDP细胞，0.25%胰酶消化后，接种于置有盖玻片的24孔板中，实验分为A549/DDP空白血清组、补中益气汤含药血清组、siRNA处理组和阴性对照组。细胞贴壁后，A549/DDP空白血清组加入含有10%的空白血清的培养基，A549/DDP含药血清组加入含有10%的中剂量补中益气汤含药血清作为培养基，siRNA处理组将细胞进行转染后，使用空白血清作为培养基，阴性对照组正常培养。继续培养48 h后取出盖玻片,4%多聚甲醛固定，3%H2O2孵育20 min，山羊血清封闭30 min，滴加一抗4 ℃在湿盒中孵育过夜。生物素标记二抗，作用30 min后，DAB显色剂显色，苏木素复染，常规处理后，封片。阴性对照以PBS代替一抗，余同上。用Quantity One图像分析软件进行分析，以细胞质/膜或核中出现粗细一致的棕黄色颗粒作为阳性，随机取 5 个视野，在 400 倍高倍镜下，计数细胞，测出阳性反应细胞的总面积(Area)和吸光度(Absorbance)，求出平均光密度(AOD)。

1.2.7按试剂盒说明进行转染，将siRNA以200 mmol/L的终浓度接种于A549/DDP细胞培养液，孵育48 h后，搜集细胞。取对数生长期的A549/DDP细胞，按照密度为1×105个/ml，接种96孔板，每孔加液量为200 μl。分设A549/DDP组、补中益气汤含药血清组和siRNA组，各组均取5种DDP质量浓度:25、50、100、200、400 mg/L。继续培养72 h后，加入浓度为5 mg/ml的MTT，20 μl/孔，孵育4 h后，加二甲基亚砜(DMSO)，150 μl /孔，静置10 min，于酶标仪 570 nm 读取吸光度值。根据公式：耐药倍数RI=耐药细胞IC50/敏感细胞IC50，计算出RI。

2 结 果

2.1Western 印迹 siRNA-P-gp作用后P-gp蛋白表达强度至(81.66±1.73)%(P<0.01)，补中益气汤作用A549/DDP细胞后能够降低其P-gp蛋白的表达强度至(85.29±2.36)%(P<0.01);与siRNA类似。见图1。

2.2免疫细胞化学法检测细胞中P-gp蛋白的表达 P-gp蛋白于细胞膜和细胞浆中表达较多，A549/DDP空白血清组中胞质棕黄色，深染，有大量棕黄色颗粒，表达呈强阳性；A549/DDP含药血清组同siRNA组仅局部细胞胞质呈棕黄色，表达明显降低，且差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

1：A549/DDP空白对照组；2：阴性对照组；3：siRNA-处理组；4：补中益气汤含药血清组

A549/DDP空白对照组 siRNA-处理组

补中益气汤含药血清组 阴性对照组

2.3RT-PCR A549/DDP空白血清组mRNA表达为1，siRNA-P-gp作用后mRNA表达强度降至(32.32±0.59)%(P<0.05),补中益气汤含药血清作用A549/DDP细胞后能够降低其P-gp mRNA的表达强度至(49.41±4.83)%(P<0.05)。

2.4对A549/DDP细胞的耐药逆转作用 将3组细胞进行药敏实验，经siRNA干扰P-gp mRNA及补中益气汤含药血清处理后，A549/DDP细胞对顺铂的IC50显著降低，A549/DDP组、siRNA组、补中益气汤含药血清组IC50值分别为(36.15±0.37)、(13.24±0.15)、(17.98±0.84)μmol/L，RI分别降至2.73和2.01，具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

肺癌是世界上发病率和死亡率均居首位的恶性肿瘤，它的发生发展是一个复杂的多阶段过程,与基因和多种分子水平变化有关，顺铂是目前临床治疗肺癌的基本药物，肺癌细胞对 DDP 耐药是化疗失败的重要原因之一〔4〕，研究表明，p-gp蛋白与该类药物耐药密切相关，其过度表达可明显影响药物的胞内转运和分布,从而导致靶点药物有效浓度下降而介导耐药〔5〕。siRNA是一种由dsRNA介导的基因沉默过程，作为一种新的研究工具，这项技术是近年来肿瘤研究的热点之一，可消除或减少特异基因活性，导致相应组织靶基因功能切除，从而产生靶定破坏基因的效果，特异性地抑制目的基因的表达〔6〕，具有高效性，稳定性，高度序列特异性，操作简单等特点〔7〕。本研究结果显示，耐药细胞经过补中益气汤含药血清作用后能有效降低P-gp mRNA和蛋白的表达，提高对顺铂的化疗敏感性，其机制可能与沉默P-gp后减低膜表面转运蛋白有关。

4 参考文献

1郑 伟，高振华，田 欣.培美曲塞联合卡铂治疗老年晚期非小细胞肺癌的临床观察〔J〕.中国老年学杂志，2008；28(5)：485-6.

2Stewart DJ.Mechanism of resistance to cisplatin and car-boplatin〔J〕.Crit Rev Oncol Hematol,2007;63(1):12-31.

3胡 强，汪宏云，杨勇刚.补中益气汤防治晚期肺癌化疗毒副反应临床观察〔J〕.实用中医药杂志，2008；25(5):271-2.

4Loo TW,Clarke DM.Do drug substrates enter the common drug-binding pocket of P-glycoprotein through“gates” 〔J〕?Briochem Riophys Res Commun,2005;329(3):419-22.

5董 岩，赵晓红，纪 萍.P53和LRP蛋白在非小细胞肺癌中的表达及意义〔J〕.青岛大学医学院学报，2003；39(4):457-8.

6Cheng JC,Moore TB,Sakamoto KM.RNA interference and human disease 〔J〕.Mol Genet Metab,2003;80(1/2):121.

7Kaelin WG Jr，Molecular B.Use and abuse of RNAi to study mammalian gene function[J].Science,2012;337(6093):421.