基质金属蛋白酶-1基因多态性与老年脑梗死患者颈动脉粥样硬化程度的相关性

张晋霞 张志勇 刘 斌 李世英 史富华 张 蕊

(河北联合大学附属医院神经内科,河北 唐山 063000)

颈动脉粥样硬化特别是不稳定性粥样硬化斑块的形成是脑梗死重要的病因和危险因素，基质金属蛋白酶(MMPs)是一组能降解细胞外基质的锌依赖性蛋白酶，MMP-1可以通过降解血管内膜和粥样斑块纤维帽的Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白促进粥样斑块进入不稳定状态，从而增加斑块破溃、脱落和出血的风险，导致脑梗死的发生〔1〕。MMP-1基因启动子区域在-519位点存在A/G单核苷酸多态性，可以对MMP-1的表达以及外周血MMP-1的水平有较大影响，导致其对粥样斑块有不同的作用程度，从而影响动脉粥样硬化的发展〔2〕。本研究分析老年动脉粥样硬化脑梗死患者MMP-1基因多态性和动脉粥样硬化程度的关系，从基因水平探究脑梗死的发病机制。

1 资料及方法

1.1一般资料 选取我院神经内科2011年6月至2013年6月期间收治的120例老年脑梗死患者，均经头部CT和MRI检查，符合全国第四届脑血管病学术会议中《各类脑血管疾病诊断要点》中脑梗死的诊断标准〔3〕，并经颈动脉超声检查证实存在颈动脉粥样硬化斑块；排除外伤、药物和脑血管畸形等其他原因导致的脑梗死。根据颈动脉超声检查结果分为不稳定斑块组60例和稳定斑块组60例。不稳定斑块组男性32例，女性28例，年龄49～77岁，平均(55．4±4.6)岁；稳定斑块组男性33例，女性27例，年龄48～74岁，平均(54．8±4.2)岁。另选取同期在本院接受体检的健康者120例为对照组，其中男性64例，女性56例，年龄46～79岁，平均(53.6±5.6)岁，排除有心脑血管疾病史和脑梗死家族史。各组无血缘关系，性别、年龄以及吸烟、高血压、高血脂、糖尿病等其他危险因素无显著性差异(P>0.05)。

1.2颈动脉超声检查 采用HPSONOS 5500彩色多普勒超声诊断仪，探头频率设定为10 MHz。分别检测双侧颈总动脉(CCA)、颈总动脉分叉处(BIF)及颈内动脉(ICA)颅外段。测量并记录颈动脉内膜-中层厚度(IMT)、管壁内径和粥样硬化斑块回声强度。诊断标准：IMT>1．2 mm为斑块形成，而易损斑块表面呈薄的高反射亮区，表面粗糙，有火山口样龛影，偏心指数(斑块厚度/对侧IMT厚度)>2。

1.3外周血MMP-1水平检测 观察组和对照组分别于体检后第2天和入院第2天清晨采集空腹静脉血3 ml，采用酶联免疫吸附法测定。

1.4聚合酶链反应(PCR)-限制性酶切片段长度多态性(RFLP)

1.4.1提取DNA 统一采集受检者清晨2 ml静脉血，于离心机中2 500 r/min离心10 min，丢弃上层血清，收集下层细胞沉淀。使用福州迈新生物技术公司生产的DNA提取试剂盒，采用低渗溶血、酚/氯仿法从白细胞中抽提DNA，适量双蒸水溶解，核酸分析仪测定DNA浓度，并在-70℃的环境中保存留作备用。

1.4.2PCR 引物序列由上海生物工程服务有限公司合成，上游引物为5′-AGGACTACAGGTGCATGACT-3′,下游引物为5′-CACAGGTCAAAGAGTACTCC-3′。PCR扩增反应体系为25 μl，包括TaqDNA聚合酶0.25 μl，10×PCR缓冲液2.5 μl，上、下游引物各为1 μl，dNTP混合物2 μl、模板DNA 1 μl，不足部分的体积用灭菌蒸馏水补足到25 μl。置于热循环仪(Bio-Rad)中95℃预变性5 min， 按照：95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s的步骤循环30次，末次循环后，72℃延伸5 min。

1.4.3RFLP分析 PCR产物以限制性内切酶KpnⅠ(上海生物工程服务有限公司)酶切消化。酶切反应体系为20 μl：PCR产物17 μl、10×PCR缓冲液2 μl、KpnⅠ酶1 μl。将酶切体系置于37℃保温箱温育16 h，终止反应。将酶切产物在12%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后EB染色，判断电泳结果并摄片。

1.5统计学方法 采用SPSS11.4统计软件，按Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验样本的群体代表性，进行χ2检验和t检验。

2 结 果

2.1MMP-1基因-519A/G基因型分析 经过PCR扩增的产物片段长度为469 bp，依据限制性内切酶KpnⅠ酶切片段的结果可将其基因型分为三种：AA纯合型(238、231 bp，因为两片段长度相差仅7 bp，琼脂糖凝胶电泳不能分辨，故只显示一条带)、AG杂合型(469、238、231 bp，两条带，原因同上)、GG纯合型(469 bp，1条带)。

2.2各组血清MMP-1含量比较 梗死组MMP-1血清含量〔(1.39±0.33)μg/L〕明显高于对照组〔(0.83±0.04)μg/L〕(t=18.45,P<0.05)；不稳定斑块组和稳定斑块组外周血MMP-1浓度比较〔(1.40±0.36) vs (1.38±0.34)μg/L〕差异无统计学意义(t=0.31,P>0.05)。

2.3各组MMP-1基因型及等位基因分布频率比较 MMP-1基因 -519A/G的基因型在两组中的分布频率，经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，符合遗传平衡的标准，满足群体代表性。梗死组和对照组均存在AA、AG、GG三种基因型，且AA基因型及A等位基因在梗死组中的分布频率明显高于对照组(P<0.05)。不稳定斑块组和稳定斑块组MMP-1基因-519A/G位点基因型、等位基因频率分布有显著差异(P<0.05)。AA基因型以及A等位基因在不稳定斑块组中的分布频率明显高于稳定斑块组(P<0.05)，见表1。

表1 各组MMP-1基因型及等位基因分布频率比较〔n(%)〕

3 讨 论

脑梗死的发病与遗传和环境均有重要关系，许多与之有关的基因如与血脂代谢相关的基因和MMPs基因逐步被发现〔4〕。目前认为MMPs基因多态性可能与颈动脉粥样硬化程度相关，并通过相关机制影响脑梗死的发病。

颈动脉粥样硬化是脑梗死的重要危险因素，不仅因为动脉粥样斑块造成的动脉狭窄使远端脑组织呈低灌注状态导致脑梗死，还因为在动脉粥样硬化发展过程中，斑块性质会发生变化，可能发生破溃、脱落而使远端血管栓塞，或者因血小板和凝血因子被斑块暴露的脂质和胶原纤维激活而启动凝血反应，形成血栓而引发脑梗死〔5〕。所以任何引起颈动脉粥样斑块稳定性发生改变的因素都可能使脑梗死的风险大大增加。Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白是粥样硬化斑块纤维帽的主要结构蛋白，也是组成血管内膜的主要蛋白，对维持粥样硬化斑块纤维帽和血管内膜的完整性有至关重要的作用〔6〕。MMP-1的主要作用即为降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白，因此其与动脉粥样硬化斑块的稳定性有密切的关系。

MMP-1是MMPs家族中表达最多的肠胶原酶，主要由成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞和上皮细胞等分泌。MMPs家族是一个依赖锌、钙离子的蛋白水解酶家族，其主要作用是降解细胞外基质，还具有促进炎性细胞浸润、促进血管平滑肌细胞的增殖和移行以及促进血管生成的作用〔7，8〕。在创伤愈合、修复及重构等病理过程中，MMPs表达量会明显升高，在动脉粥样硬化的发生和发展中，MMPs也有重要作用。MMPs根据底物亲和力的不同主要分为胶原酶、明胶酶、基质溶解素、膜型MMPs四类，MMP-1即属于胶原酶的一种。MMP-1基因定位于11q22，与其他MMPs家族的基因及两个假基因紧密连锁，全长8 244 bp，由9个内含子和10个外显子组成，其编码的MMP-1能够降解间质胶原如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原〔9〕。MMP-1基因属可诱导表达基因，在活跃的生理性或病理性组织重构中表达水平明显升高。MMP-1基因启动子区域存在多个单核苷酸多态性位点，如在-1607位点存在1G/2G单核苷酸多态性，在-519位点存在A/G单核苷酸多态性。研究发现-519位点位于基因启动子的保守区域，该区域单核苷酸多态性可影响转录因子和启动子区的结合，从而影响MMP-1基因转录，使MMP-1表达水平改变〔10〕。

综上，脑梗死的发病与遗传和环境均有重要关系，MMP-1基因-519A/G多态性与脑梗死的发病和颈动脉粥样硬化程度相关，其中AA基因型和A等位基因可能会降低颈动脉粥样硬化斑块的稳定性，增加脑梗死的发病风险。但脑梗死发病机制复杂，并且MMP-1基因型的分布和种族及地域有关，因此，MMP-1基因-519A/G多态性与脑梗死的发病和颈动脉粥样硬化程度的相关性仍需大量研究证实。

4 参考文献

1Peng B,Cao L,Wang W,etal.Polymorphisms in the promoter regions of matrix metalloproteinases 1 and 3 and cancer risk: a meta-analysis of 50 case-control studies〔J〕.Mutagenesis，2010;25(1)：41-8.

2Wang HY,Masaki Ogawa,Jennifer R,etal.Genetic and epigenetic mechanisms combine to control MMP1 expression and its association with preterm premature rupture of membranes〔J〕.Human Molec Genet，2008;17(8)：1087-96.

3张晋霞,张志勇,刘 斌,等.基质金属蛋白酶-1基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死相关性研究〔J〕.检验医学与临床,2013;10(12):1491-2.

4朱海勇,金笑平,朱 敏,等.基质金属蛋白酶-1基因多态性与颈动脉斑块稳定性的关系〔J〕.中风与神经疾病杂志,2011;28(10):903-5.

5谢明剑，薛伟新,邱楚雄,等.脑梗死病人梗死面积与MMP1，MMP9，TIMP1的关系探讨〔J〕. 中西医结合心脑血管病杂志,2011;9(2):173-4.

6姜红菊,张 梅,李大庆,等.冠心病患者基质金属蛋白酶-1基因多态性〔J〕.中国动脉硬化杂志,2010;13(5):589-92.

7袁雅冬,张 颖,孙长虹.血管紧张素转化酶及基质金属蛋白酶-1基因多态性与特发性肺纤维化的相关性〔J〕.中华结核和呼吸杂志,2013;36(1):38-43.

8周庆辉,黄秀峰,王金花，等.广西壮族男性膜型基质金属蛋白酶1基因多态性与骨质疏松症的相关性〔J〕.中华医学遗传学杂志,2012;29(3):309-13.

9王浩坤,赵洛沙,周 帅,等.河南省汉族人群基质金属蛋白酶-1基因-519A/G多态性及其血浆水平与急性冠状动脉综合征的相关性分析〔J〕.临床心血管病杂志,2010;26(5):371-4.

10谢明剑,邱楚雄,薛伟新,等.脑梗死患者基质金属蛋白酶1，9及其组织抑制因子1与血脂关系的研究〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志,2009;7(10):1168-9.