依达拉奉对大鼠脑缺血后中脑微血管密度、神经生长因子、脑源性神经生长因子表达的影响

朱 江 高燕军 窦志杰 米艳娟 孙艳军 龙雅君 韩玉敏

(承德医学院附属医院神经内科，河北 承德 067000)

神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)可以明显促进缺血后神经元的存活和生长发育，改善神经元的病理状态，促进受损神经元再生及分化成熟，在中枢神经系统损伤修复过程中具有重要的作用〔1〕。近年来研究发现，BDNF和NGF对于新生血管亦有诱导和促进形成的作用〔2〕。依达拉奉是一种新型脑保护剂，具有清除自由基和神经保护作用〔3〕,可抑制脑细胞的过氧化作用和延迟神经元死亡，并减轻脑缺血和脑缺血引起的脑水肿和组织损伤〔4〕。本研究从依达拉奉对大鼠缺血脑组织中NGF和BDNF表达的改变及其最终对微血管分布的影响的角度，对依达拉奉在脑缺血过程中起到的保护作用进行深入的探讨。

1 材料与方法

1.1动物与分组 60只Wistar成年健康雄性大鼠，220～240 g，购于河北医科大学实验动物中心。随机分为假手术组，治疗组，缺血对照组。按时间点分为7、14 d两个亚组，其中假手术组每个亚组6只，其余每个亚组12只。

1.2方法

1.2.1脑缺血模型制备 结扎双侧颈总动脉：10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg),仰卧固定，颈部正中切口，钝性分离胸锁乳突肌，暴露分离出双侧颈总动脉并结扎切断，检查无活动性出血后，用生理盐水和青霉素(1×105U/L)冲洗后缝合伤口。电凝椎动脉：大鼠俯卧固定，于后正中线第1颈椎水平处作纵形切口，沿中线分开肌层，暴露第1颈椎横突孔，将高频电刀的电凝刀头插入右侧横突孔内凝闭椎动脉3～4 s，检查无活动性出血后，用生理盐水和青霉素(1×105U/L)冲洗后缝合伤口。待清醒后，单笼保温喂养。

1.2.2实验动物的干预方法 假手术组只暴露双侧颈总动脉及右侧椎动脉，不做血管阻断处理。治疗组、缺血对照组均在阻断双侧颈总动脉及右侧椎动脉后立即开始治疗。实验组腹腔注射依达拉奉2次/d，时间间隔12 h，每次注射计量按3 mg/kg计算，到术后7、14 d两个时间点分别处死，取中脑脑组织。缺血对照组腹腔注射生理盐水2次/d，时间间隔12 h，注射剂量为0.5 ml/次。到术后7、14 d两个时间点分别处死，取中脑脑组织。

1.2.3实验标本制作 应用10%水合氯醛 (350 mg/kg)，腹腔注射。仰卧位固定于鼠板上，快速剪开腹腔和胸腔的前壁，清晰的暴露出心脏，用连有输液管的预先处理为钝圆的针头插入左心室内，快速输入温生理盐水(37℃)100 ml，同时用眼科剪剪破右心耳，此时血液由右心耳处流出，待大鼠四肢末端变白，换上4%多聚甲醛〔0.1 mol磷酸盐缓冲液(PBS)配成pH 7.4〕灌流固定。灌流结束后取出脑组织，用冰生理盐水冲洗，除去血液。石蜡包埋切片。

1.2.4观察指标 ①微血管密度：每只大鼠取3张切片，采用Simple PCI-8图像分析软件分析脑组织微血管灰度。每张切片在光镜下选5个视野，取平均灰度值进行统计学分析。该分析仪器的灰度级为0～256灰级，平均灰度表示阳性细胞的反应强度，平均灰级越高，说明反应强度越低。②神经营养因子：NGF、BDNF蛋白表达的测定用SP免疫组织化学染色法，所有切片染色均采用相同条件，每批染色均设阴性对照。阴性对照用PBS替代一抗孵育切片。结果判定：阳性细胞的胞浆、胞膜、轴突呈棕黄色着色。图像分析：用Simple PCI-8图像分析软件对图像进行统计学分析。每张切片在光镜下选5个视野，取平均灰度值进行统计学分析。该分析仪器的灰度级为0～256灰级，平均灰度表示阳性细胞的反应强度，平均灰级越高，说明反应强度越低。

2 结 果

2.1各组脑组织中NGF、BDNF灰度值的变化 通过对7、14 d后实验动物的观察，治疗组及缺血对照组中灰度值较假手术组显著增加。但是，治疗组NGF、BDNF灰度值增加的程度低于缺血对照组。其中，治疗组各时段NGF、BDNF灰度值均低于缺血对照组。与假手术组比较有统计学差异(P<0.05)。见表1。

2.2各组脑组织中微血管灰度的变化 通过对7、14 d后实验动物的观察，治疗组及缺血对照组的微血管灰度值较假手术组均增加。治疗组数值增加的幅度低于缺血对照组。其中，治疗组微血管灰度值在各时段均低于缺血对照组。与假手术组相比较二者均有统计学差异(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠脑组织中NGF、BONF蛋白阳性表达灰度值及微血管灰度值比较±s)

3 讨 论

脑缺血后，脑神经元损伤的程度与BDNF和NGF的表达水平密切相关〔5,6〕。脑缺血后，BDNF、NGF均增加〔7〕，通过拮抗兴奋性氨基酸毒性，稳定细胞内钙离子浓度；增强抗氧化酶活性，减轻自由基损伤；抑制细胞凋亡，增强蛋白酶活性；修复受损神经元，促进神经元再生机制〔8〕提高神经元的抗损伤能力〔9〕。

在脑缺血后，出现神经元数量及微血管密度的减少，神经胶质细胞数量的增加。在缺血条件下，神经胶质细胞大量增生填充于坏死区域，引起局部微循环障碍，即微血管凋亡的数量大于其新生的数量。研究发现BDNF参与内皮细胞的调解，与血管新生有关。BDNF是神经营养因子，对神经细胞的生长发育、损伤修复有重要作用〔10〕。有研究证实，100 μg/L的BDNF体外促内皮细胞血管新生能力与25 μg/L血管内皮生长因子(VEGF)相当，为一种新的促血管新生因子〔11〕。在体外促进内皮细胞生长，在体内诱导血管的发生。

依达拉奉是目前临床上广泛使用的自由基清除剂，可通过血脑屏障，抑制脂质过氧化反应，减轻脑组织花生四烯酸引起的脑水肿，缩小缺血半暗带的面积，抑制迟发性神经细胞的死亡，还可以防止血管内皮细胞损伤。依达拉奉清除自由基，提高BDNF、NGF水平，进一步影响血管新生数量。

本研究提示依达拉奉不仅具备清除自由基的作用，还可以通过激发NGF途径对神经元起到保护作用。更重要的是，微血管密度增加可从根本上改善脑组织缺血造成的损伤。同时提示微血管密度增加可促进NGF、BDNF的表达，NGF又进一步刺激微血管新生，即二者之间是相互促进的正性刺激过程。

4 参考文献

1董为伟.神经保护的基础与临床〔M〕.北京：科学出版社，2002: 239-45.

2胡 豫，孙春艳，王雅丹，等.脑源性神经营养因子(BDNF)在多发性骨髓瘤患者血浆中的表达增高及其意义的初步研究〔J〕. 中国实验血液学杂志，2005;13(1)：104-9.

3Shimon A,Tatsushi K,Chikako N,etal.Anti-apoptotic and neuroprotective effects of edaravone following transient focal ischemia in rats〔J〕. Eur J Pharmacol,2005;516(2):125-30.

4杨 政，吴玉林.治疗急性脑梗死的新型脑保护药依达拉奉〔J〕.中国新药杂志，2002;11(12)：911-3.

5Jia HP,Schutte BC,Schudy A,etal.Discovery of new human beta-defensins using a genomics-based approach〔J〕.Gene,2001;263(1-2): 211-8.

6Gura T,Innate immunity.Ancient system gets new respect〔J〕. Science,2001;291(5511):2068-71.

7陈景红，高俊淑，李 娜，等.老年急性脑梗死患者VEGF和GFAP水平的动态变化〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(4)：687-8.

8Lemaitre B,Reichhart JM,Hoffmann JA.Drosophila host defense:differential induction of antimicrobial peptide genes after infection by various classes of microorganism〔J〕. Proc Natl A cad Sci USA,1997;94(26):14614-9.

9方秀斌.神经肽与神经营养因子〔M〕. 北京：人民卫生出版社，2002:289-94.

10王雅丹，胡 豫，孙春艳. AKt、ERK1/2活化在脑源性神经营养因子促血管新生中的作用〔J〕. 中国病理生理杂志，2007;23(5)：833-8.