白木香果皮提取物清除DPPH自由基能力及抑制酪氨酸酶活性的研究

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1.广东省微生物研究所，省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州510070；2.广东药学院，广东 广州510006

白木香果皮提取物清除DPPH自由基能力及抑制酪氨酸酶活性的研究

李浩华1章卫民1*陈玉婵1高晓霞2严寒静2

1.广东省微生物研究所，省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州510070；2.广东药学院，广东 广州510006

目的研究白木香果皮不同溶剂提取物清除DPPH自由基的能力及对酪氨酸酶活性的抑制作用，为白木香果皮的应用和开发提供理论依据。方法以水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和石油醚5种极性不同的溶剂，采用回流、超声、冷浸方法提取白木香果皮，采用DPPH法和L-DOPA法分别测定提取物对DPPH自由基的清除能力和酪氨酸酶活性的抑制作用。结果极性较大的水、乙醇提取物对DPPH自由基均有显著的清除能力，其IC50值分别为26.9、19.9μg/ml；而极性中等的丙酮、乙酸乙酯提取物则对酪氨酸酶活性具有较为明显的抑制作用，其IC50值分别为93.2、122.9μg/ml。结论白木香果皮提取物具有开发天然有效的自由基清除剂和酪氨酸酶抑制剂的潜力。

白木香果皮；提取物；DPPH；酪氨酸酶

白木香Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg为瑞香科沉香属植物，是一种热带、亚热带常绿乔木，分布于广东、广西、海南、云南及台湾等地，为我国唯一产沉香的植物资源[1]。沉香是我国传统珍贵中药，具有行气止痛，温中止呕，纳气平喘之功效，主治胸腹胀闷疼痛，胃寒呕吐呃逆，肾虚气逆喘急等症[2]，临床用于治疗寒性胃痛、老年性肠梗阻、便秘、哮喘等[3]。目前对白木香的利用主要通过人工造香使其树干产生沉香药材，但由于结香周期长，且采香后其余材料被废弃，以致对白木香资源的利用率很低。为提高该植物资源利用率和经济效益，人们开始关注白木香果、叶的开发研究。白木香树每年可产生大量的果实，是一种具有开发潜力的可再生资源，研究表明白木香果实及种子分别具有抗肿瘤和抗菌活性[4、5]。为了进一步发掘白木香果皮的新用途和功能，本研究通过DPPH法和L-DOPA法对白木香果皮提取物进行DPPH自由基清除能力和酪氨酸酶活性抑制作用的研究，以期为白木香果皮的开发利用提供理论依据。

1 仪器与材、试剂

1.1 材料 白木香果实由广东省信宜市珍稀沉香发展有限公司提供，经广东药学院中药学院严寒静副教授鉴定为白木香Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg的果实。果实置于室内阴干，将种子从果实中去除后即为果皮，保存于广东省微生物研究所。

1.2 试剂 2,2-二苯基-1-苦肼基(DPPH)、维生素C、酪氨酸酶(Tyrosinase，3933 U/mg)、3,4-二羟基苯丙氨酸(L-dopa)，均购自Sigma公司；其余试剂均为分析纯，购自广州化学试剂厂。

1.3 主要仪器 RE-2000型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；超净工作台(上海恒益科技有限公司)；Multiskan酶标仪(Thermo公司)。

2 方法

2.1 不同溶剂的白木香果皮提取物制备

2.1.1 水提取物的制备 将白木香果皮用纯净水100 ℃回流提取2次，每次2 h，过滤，合并2次提取液，旋转蒸发仪浓缩至干，得白木香果皮水提物浸膏。

2.1.2 乙醇提取物的制备 将白木香果皮用70%乙醇在超声波频率为40 KHz下超声提取2次，每次30 min，过滤，合并2次提取液，旋转蒸发仪浓缩至干，得乙醇提取物浸膏。

2.1.3 丙酮提取物的制备 将白木香果皮用丙酮60 ℃回流提取2次，每次2 h，过滤，合并2次提取液，旋转蒸发仪浓缩至干，得丙酮提取物浸膏。

2.1.4 乙酸乙酯提取物的制备 将白木香果皮用乙酸乙酯80 ℃回流提取2次，每次2 h，过滤，合并2次提取液，旋转蒸发仪浓缩至干，得乙酸乙酯提取物浸膏。

2.1.5 石油醚提取物的制备 将白木香果皮用石油醚冷浸2次，每次24 h，过滤，合并2次提取液，旋转蒸发仪浓缩至干，得石油醚提取物浸膏。

2.2 白木香果皮提取物清除DPPH自由基能力的测定

2.2.1 不同提取物清除DPPH自由基能力的测定 参照Turkoglu等[6]方法，将白木香果皮各提取物和维生素C用无水乙醇配制成浓度为400μg/ml溶液，DPPH用无水乙醇配制成0.2mmol/L的溶液。吸取提取物溶液100μl于96孔板中，加入浓度为0.2mmol/L的DPPH溶液100μl作样品组，以无水乙醇溶液作参比溶液，以无水乙醇代替DPPH溶液作样品背景组，以无水乙醇代替提取物溶液作阴性对照组，以维生素C溶液代替提取物溶液作阳性对照组，置30 ℃培养箱中反应30 min，用酶标仪测定每孔517 nm处的吸光值(A)，按以下公式计算提取物对DPPH自由基的抑制率：清除率(%)={1-(A样品组/阳性组-A背景组)/A阴性组}×100%。

2.2.2 不同浓度的提取物清除DPPH自由基能力的测定 将白木香各提取物溶液用无水乙醇稀释至400、200、100、50、25、12.5、6.25μg/ml，按“2.2.1”项的测定方法测吸光值，计算提取物对DPPH自由基的抑制率，并采用SigmaPolot 10.0 软件计算对DPPH自由基清除的IC50值。

2.2.3 不同作用时间下清除自由基能力的测定 将各提取物溶液用无水乙醇溶液稀释至200μg/ml，按“2.2.1”项的测定方法测吸光值，每隔10min测定1次，共测定7次，观察白木香果皮各提取物在不同作用时间下对DPPH自由基清除能力的影响。

2.3 抑制酪氨酸酶活性的测定 参照二酚酶活力的测定方法[7]，将白木香果皮各提取物用DMSO溶解，用pH6.8的PBS缓冲液分别稀释至5000、2000、1000、500、200μg/ml，酪氨酸酶和L-dopa用PBS缓冲液分别配制成活力为10 U/ml和浓度为10 mmol/L溶液。以L-dopa溶液为底物，吸取该溶液160μL于96孔板中，加入20μl各浓度提取物稀释液及20μl酪氨酸酶溶液作样品组，以PBS缓冲液作参比，以PBS缓冲液代替酪氨酸酶溶液作样品背景组，以PBS缓冲液代替提取物溶液作阴性对照组，置37℃培养箱静止作用30 min，用酶标仪测定每孔475nm处的吸光值(A)，按以下公式计算白木香果皮各提取物对酪氨酸酶活性的抑制率，并采用SigmaPolot 10.0 软件计算IC50值。抑制率(%)={1-(A样品组/阳性组-A背景组)/A阴性组}×100%。

3 结果

3.1 白木香果皮提取物清除DPPH自由基的能力 白木香果皮的不同溶剂提取物(水、乙醇、乙酸乙酯、丙酮)在200μg/ml浓度下对DPPH自由基均有显著的清除能力，清除率均达95%以上，在相同浓度下与维生素C的清除能力相当，而石油醚提取物对DPPH自由基则几乎没有清除作用，结果见表1。

3.2 不同浓度提取物清除DPPH自由基的能力 不同溶剂提取的白木香果皮提取物对自由基的清除能力不同，其IC50值由小到大依次为：乙醇提取物、水提取物、丙酮提取物、乙酸乙酯提取物。另外，不同溶剂的提取物对自由基的清除率与其浓度大小成正比，浓度越高，其清除能力越强，呈一定的量效关系，结果见表2。

表1 不同溶剂的提取物对DPPH自由基的清除能力±s, n=3)

表2 不同浓度的提取物对DPPH自由基清除率

表3 不同作用时间下对DPPH自由的基清除率

表4 对酪氨酸酶活性的抑制率(%)

注：“-”代表对酪氨酸酶活性有激活的作用；“N”表示未计算IC50值。

3.3 不同作用时间下对DPPH自由基的清除能力 白木香各提取物在200μg/ml浓度下对DPPH自由基清除能力均随作用时间的延长而增强，在作用30min时，清除率在85%～90%之间，当作用30 min后，各提取物对自由基的清除率则均趋于稳定，结果见表3。

3.4 白木香果皮提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用 白木香果皮的丙酮提取物和乙酸乙酯提取物在500μg/ml浓度下，对酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用，抑制率均达75%以上，IC50值分别为93.2和122.9μg/ml，水提物、乙醇提取物和石油醚提取物对酪氨酸酶的抑制作用则不明显，结果见表4。

4 讨论

本研究结果表明白木香果皮提取物具有清除DPPH自由基的能力和抑制酪氨酸酶活性的作用。不同溶剂提取的白木香果皮提取物对DPPH自由基的清除能力明显不同，其中用极性较大或中等的溶剂(水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯)得到的提取物对DPPH自由基具有显著的清除能力，而用极性小的石油醚得到的提取物对自由基则几乎没有清除能力，说明白木香果皮提取物中清除自由基的主要活性成分可能为极性较大或中等的物质。由于水提物和醇提物清除DPPH自由的IC50值均较低，因此，从开发天然抗氧化剂的成本考虑，利用水提比较合适。此外，不同溶剂提取的白木香果皮提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用也不同，其中用中等极性的丙酮、乙酸乙酯得到的提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用较为明显，而用极性大的水、乙醇和极性小的石油醚得到的提取物对酪氨酸酶的抑制作用不明显，说明白木香果皮提取物中抑制酪氨酸酶活性的主要成分可能为中等极性的物质。

白木香果实资源丰富，但人们采集果实后，除了种子用于育苗外，果皮部分被废弃。为充分利用白木香果皮这一废弃资源，作者曾对白木香果皮的三氯甲烷提取物进行化学成分分析，发现其果皮中含有大量的沉香特征性成分，且该提取物对肿瘤细胞株具有抑制活性[8]和广谱的抗菌活性[9]。本研究结果进一步显示白木香果皮具有多种生物活性，为今后进一步通过活性跟踪分离提取不同活性的有效成分奠定了基础，同时也为今后对白木香果皮的应用和开发提供了理论依据。

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[8] 徐维娜， 高晓霞， 郭晓玲， 等． 白木香果皮挥发性成分及抗肿瘤活性的研究[J]．中药材，2010，33(11)：1736-1739．

[9] 李浩华，章卫民，高晓霞， 等．白木香果皮提取物的抗菌活性研究[J]．中国实验方剂学杂志，2011，17(7)：112-115．

StudyonscavengingDPPHfreeradicalactivityandinhibitoryeffectontyrosinaseofAquilariasinensispeelextract

LI Hao-hua1ZHANG Wei-min1*CHEN Yu-chan1GAO Xiao-xia2YAN Han-jing2

1.State Key Laboratory of Applied Microbiology, South China (The Ministry—Province Joint Development), Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application; Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology; Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China; 2.Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006, China

Objective: To evaluate the scavenging DPPH free radical activity and inhibitory effect on tyrosinase of Aquilaria sinensis peel extract, thus providing a theoretical basis for the application and development of A. sinensis peel. Method: Water, ethanol, buthanol, ethyl acetate and petroleum ether were used as solvents, and reflux, ultrasonic wave, soaking were employed to extract peel of A. sinensis. The radical scavenging activity and inhibitory effect on tyrosinase were determined by the DPPH assay and L-DOPA assay, respectively. Results: Water and ethanol extracts exhibited significant scavenging capabilities on DPPH free radical with the IC50 values of 26.9, 19.9μg/ml, respectively. The buthanol and ethyl acetate extracts of A.sinensis peel displayed good tyrosinase inhibitory activities with the IC50 values of 93.2, 122.9μg/ml, respectively. Conclusion: The extract of A. sinensis peel has the potential to explore effective natural free radical scavengers and tyrosinase inhibitors.

Aquilaria sinensis peel; extract; DPPH; tyrosinase

广东省中国科学院全面战略合作项目(2011B090300078)；广东省科技计划项目(2012A030100014)。

李浩华，女，助理研究员，主要从事药用微生物资源及其活性物质研究。E-mail:hhli100@126.com.

章卫民，E-mail:wmzhang58@qq.com.

R285.5

A

1007-8517(2014)08-0036-03

2014.03.17)