HPLC法测定红花地上部分羟基红花黄色素A和木犀草素的含量

内蒙古民族大学，内蒙古 通辽 028000

HPLC法测定红花地上部分羟基红花黄色素A和木犀草素的含量

王秀梅韩晓静白梅荣关永仙

内蒙古民族大学，内蒙古 通辽 028000

目的建立红花地上部分中羟基红花黄色素A和木犀草素的含量测定方法。方法采用HPLC法，色谱柱为Eclipse plus-C18柱(5μm，4.6mm×150mm)，流动相为甲醇-0.7%磷酸梯度洗脱，流速：1.0 ml/min，检测波长390nm，柱温30℃。结果羟基红花黄色素A在0.03μg/ml～0.19μg/ml，(r=0.999 9)；木犀草素在0.13μg/ml～0.80μg/ml，(r=0.999 5)范围内有良好的线性关系，平均回收率为99.99%，98.95%(n=6)。结论该方法简便、快捷、准确、重复性好，可用于羟基红花黄色素A和木犀草素的含量测定。

红花；高效液相色谱法；羟基红花黄色素A；木犀草素；含量测定

红花为菊科植物红花CarthamustinctoriusL.的干燥花，对于花的主要成分，国内外的许多学者进行了比较深入的研究[1]，从红花中分离得到的化学成分有醒式查尔酮普类，黄酮类，生物碱类，木脂素类，有机酸类，烷基二醇类化合物等。在红花的研究进展中研究红花地上部分中的羟基红花黄色素A和木犀草素还在初步的阶段。现代研究证明，红花的地上部分中含有木犀草素和羟基红花黄色素A[2]。以此推测，具有保肝作用，即木犀草素通过清除自由基，抑制自由基胶原蛋白基因表达，降低四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化。蒙医学两千年的临床实践证明，红花保肝作用非常显著。红花在常用保肝作用的蒙药复方中作为“君药”主导着整个复方的作用方向。为了有效控制红花地上部分的质量，特采用HPLC法测定羟基红花黄色素A和木犀草素的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent Technologies 1260lnfinty(美国安捷伦)；AUW220D电子分析天平(日本岛津)；KQ-200VDE超声仪(昆山)；RE52-AA旋转蒸发仪(上海)。

1.2 试剂试药

1.2.1 试药 红花地上部分来自内蒙古通辽，经内蒙古民族大学蒙医药学院白梅荣教授鉴定为菊科植物红花属无刺红花的茎叶。羟基红花黄色素A对照品(批号:GZGD-0552-201210)，对照品购自贵州迪大生物有限公司；木犀草素对照品(批号:111520-200504)对照品购自中国药品生物制品检定所。

1.2.2 试剂 甲醇色谱纯，其它试剂为分析纯。

2 方法与结果[3-5]

2.1 色谱条件 Eclipse plus-C18柱(5μm，4.6mm×150mm)；流动相：甲醇-0.7%磷酸按表1梯度洗脱，检测波长为390nm，柱温：30℃，流速：1.0 ml /min。理论板数按木犀草素峰计算应不低于2500。

表1 流动相梯度表

2.2 对照品溶液的制备 精密称取羟基红花黄色素A和木犀草素对照品适量，加甲醇制成含羟基红花黄色素A 12.75μg/ml和木犀草素53.5μg/ml的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取红花地上部分约1g，精密称定，置50 ml量瓶中，加入甲醇溶液50ml，侵泡30min，超声处理60min，放冷，滤过，滤液浓缩至约5ml，摇匀，作供试品溶液。

2.4 系统适用性试验 取阴性对照品、对照品和供试品溶液, 在上述色谱条件下分别进样15μl, 绘制HPLC 色图谱。由图可知供试品溶液和对照品溶液中羟基红花黄色素A和木犀草素的保留时间是一致的，结果见图。

照品HPLC色谱图 供试品HPLC色谱图

2.5 线性关系考察 精密吸取上述对照品溶液2.5、5、7.5、10、12.5、15μl进样，测定峰面积，以进样量为横坐标, 峰面积值为纵坐标, 绘制标准曲线，回归方程为:Y羟基红花黄色A=33.20336X-1.64057，r=0.9999，线性范围0.03μg/ml～0.19μg/ml;Y木犀草素=12.74316X-1.03750，r=0.9995，线性范围0.13μg/ml～0.80μg/ml。

2.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液15μL,连续进样6 次，测得羟基红花黄色素A和木犀草素峰面积RSD分别为0.26%，0.52%0(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.7 重现性试验 精密称取同一批样品，按2.3项下方法，平行制成3份供试品溶液，进样15μL测定，羟基红花黄色A和木犀草素峰面积的RSD分别为0.41%，0.56%(n=3)，表面本方法重现性良好。

2.8 稳定性试验 精密吸取供试品溶液分别于0、2、4、6、8、10、24h进样，测得羟基红花黄色素A和木犀草素峰面积RSD分别为0.70%，0.55%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的同批样品6 份,分别精密加入一定量的羟基红花黄色素A和木犀草素对照品,按2.3项下方法制备供试品溶液,按2.1项下色谱条件测定，按公式计算回收率，其RSD分别为99.99%，0.28%；98.95%，0.08%。

2.10 含量测定试验 精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各15μl,连续进样3次，按上述色谱条件测定并按外标法计算含量，羟基红花黄色A和木犀草素含量分别为7.16μg /g，0.22%；37.62μg /g，1.5%。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 以对照品溶液进行各种波长检测，结果木犀草素在350nm有最大吸收波长，羟基红花黄色素A在403nm有最大吸收波长。考虑到木犀草素在403nm的吸收波长较弱，故选择390nm为检测波长。

3.2 流动相的选择 试验过程中分别对不同比例的甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液，甲醇-0.7%磷酸溶液，不同梯度的甲醇-0.7%磷酸溶液进行了考察，结果2.1项下所选定的梯度洗脱条件分离较好，且能通过峰纯度验证，故选之。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典·第一部[S].北京:化学工业出版社,2010.141.

[2] 韩炜，杨玉林，康延国.HPLC法测定红花地上部分木犀草苷和木犀草素的含量[J].中华中医药学刊,2010，28(6),199-201.

[3] 陈曦,龙晓蕾,王志宏.高效液相色谱法测定金银花中木犀草素含量[J].湖南农业大学学报(自然科学版),2009,35(2):127-129.

[4] 李伟光,李长新.HPLC法测定筋骨草胶囊中木犀草素含量[J].中国医药指南,2009,7(13):39-40.

[5] 韩炜，邢燕，康延国.红花地上部分化学成分研究[J].中华中医药学刊,2010，28(4),211-213.

DeterminationtheContentofHydroxysaffloryellowAandLuteolininaerialpartofCarthamustinctoriusLbyHPLC

WANG Xiu-mei HAN Xiao-jing BAI Mmei-rong GUAN Yong-xian

College of Mongolian Medicine and pharmacy, Inner Mongolia University for Nationalities,Tongliao 028000,China

objective: To establish a HPLC method for determination the content of Hydroxysafflor yellow A and Luteolin in aerial part of Carthamus tinctorius L . Method: Determining the Hydroxysafflor yellow A and Luteolin in aerial part of Carthamus tinctorius L by HPLC on Eclipse plus-C18column(5μm，4.6mm×150mm) and with methanol-0.7% phosphoric acid gradient elution and the flow rate of 1.0ml·min-1. The detective wavelength was 390nm, and the temperature of the column was 30℃. Result: The obvious linear relationship were showed between the input mass of Hydroxysafflor yellow A and Luteolin as reference substance ranging from 0.03to 0.19μg and from 0.13 to 0.80μg; The average recovery of Hydroxysafflor yellow A is 99.99% and The average recovery of Luteolin is 98.95%(n=6).Conclusion: The method is simple, rapid, accurate and possesses good reproducibility. It can be used for determining the content of Hydroxysafflor yellow A and Luteolin in aerial part of Carthamus tinctorius L.

Carthamus tinctorius L.; HPLC; Hydroxysafflor yellow A; Luteolin; Determination

市校科技合作项目(SXYB2012030)

王秀梅，女，蒙古族，讲师，从事蒙药质量标准研究，Tel：18647531953，E-mail：wangxiumei1980@126.com

R284.1

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1007-8517(2014)08-0029-02

2014.02.10)