XAF1基因对肺腺癌细胞A549的作用及机制

2014-09-09陈东来张福全桑永华朱蓉英张洪涛陈勇兵

中国肺癌杂志 2014年12期

陈东来张福全桑永华朱蓉英张洪涛陈勇兵

细胞的凋亡抑制在肺癌的发生发展中起重要作用[1]。X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis, XIAP）相关因子1（XAF1）是新鉴定的肿瘤抑制基因，在许多肿瘤组织和肿瘤细胞株中低表达甚至不表达[2]。新近研究[3,4]发现，XAF1在肿瘤细胞中高表达可抑制胃癌细胞、肺鳞癌细胞的生长，并诱导肿瘤细胞凋亡，增加肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。但对肺腺癌细胞作用如何尚未见相关研究报道。本实验以重组腺病毒为载体，研究过表达XAF1基因对人肺腺癌细胞A549的增殖和诱导细胞凋亡的作用及机制，为腺病毒介导XAF1基因治疗肺腺癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料逆转录试剂盒购自Promega公司；甲基噻唑基四唑（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自BD公司；RIPA裂解液购自上海申能博彩公司；XAF1抗体购自Abcam公司；PARP、Caspase-3和Caspase-8抗体购自Cell Signaling Technology公司；β-actin抗体购自Sigma公司；RNA提取试剂盒和辣根过氧化物酶连接的二抗购自北京康为世纪公司；增强化学发光荧光试剂ECL购自Amersham bioscience公司；XAF1和β-actin引物由上海生工生物公司合成，以β-actin为内参照。

1.2 细胞培养人肺腺癌A549细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所，为贴壁细胞，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基（Gibco公司）培养和传代（37oC、5%CO2）。

1.3 重组腺病毒 Ad5/F35-XAF1和对照空病毒Ad5/F35-Null由北京本元正阳公司合成与扩增，转染滴度分别0.69×1010PFU/mL和1.26×1010PFU/mL。

1.4 逆转录聚合酶链式反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR）采用试剂盒抽取细胞总RNA，测定RNA浓度，并逆转成cDNA。XAF1引物上游：5’-TCCGCAATTCATGCTCCACGAGTCCTA CTG-3’，下游：5’-ACGCGTCGACAAACTCTGAGTCTG GACAAC-3’，产物大小260 bp。内参照β-actin引物上游：5’-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGC-3’，下游：5’-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3’，产物大小830 bp。PCR反应条件：95oC、3 min；94oC、45 s，57oC、45 s，72oC、45 s，共30个循环。最后72oC延伸6 min。PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳，100伏电压30 min电泳后在凝胶成像系统上拍照和分析。

1.5 MTT法检测细胞生长活力将对数生长期的A549原代肺腺癌细胞以5,000个/孔接种在96孔板上，24 h后，用无血清RPMI-1640稀释重组腺病毒Ad5/F35-NULL和Ad5/F35-XAF1，分别按MOI（50、100、200）加入96孔板中转染细胞，空白对照组不加任何病毒处理，置于37oC、5%CO2温箱孵育4 h后置换为含10%FBS的RPMI-1640完全培养液，继续培养48 h后收集细胞，弃去上清，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，在培养箱孵育4 h，小心吸净MTT液，后加入二甲基亚砜（DMSO）150 mL/孔，避光摇床上放置10 min，于波长570 nm处测定吸光度（A）值，细胞增殖率=（实验孔A值-空白对照孔A值）/对照孔A值×100%。各滴度梯度组均设3个复孔，每组实验重复3次，取平均值。

1.6 Annexin V-FITC/PI双染法（流式细胞仪法）将A549原代肺腺癌细胞以2×105/孔密度接种于6孔板中，按MOI 100的浓度分别加入Ad5/F35-NULL和Ad5/F35-XAF1（方法同5）。转染4 h后加入含10%FBS的RPMI-1640完全培养液，继续37oC温箱孵育48 h后制成细胞悬液。加入Annexin V-FITC和PI染色液，上流式细胞仪检测细胞凋亡率，每组重复3次，取平均值。

1.7 Western blot检测XAF1及凋亡相关蛋白的表达用RIPA细胞裂解液抽取细胞总蛋白，并用BCA方法测蛋白浓度，取50 μg蛋白质，加1/4蛋白量的5×蛋白上样缓冲液，配置10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDSPAGE）并上样，依次进行蛋白垂直电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭，分别加入特异性β-actin抗体（1:5,000）和XAF1抗体（1:1,000）以及凋亡相关蛋白Caspase-3抗体（1:1,000）、Caspase-8（1:1,000）、PARP抗体（1:1,000），4oC孵育过夜，用TBS/T洗膜后分别加入对应二抗，室温摇床2 h，ECL显像，在凝胶成像系统上拍照并分析。

1.8 统计学方法应用SPSS 16.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人肺腺癌细胞株A549中XAF1 mRNA和蛋白的表达 Ad5/F35-XAF1瞬时转染A549细胞48 h后，行PCR和Western blot法检测细胞中mRNA和蛋白的表达。结果显示，与Ad5/F35-NULL转染组相比，A549细胞中XAF1 mRNA和蛋白表达在Ad5/F35-XAF1转染48 h后明显增高（图1）。

2.2 细胞增殖率情况将A549原代细胞、转染Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-NULL三组细胞培养48 h后，MTT法提示肺腺癌A549细胞增殖率随着Ad5/F35-XAF1 MOI的升高而降低，当MOI为100和200时，细胞增殖抑制率分别为19%和52%，两者比较有统计学差异；而瞬时转染Ad5/F35-NULL 48 h后，各MOI组细胞增殖率无明显统计学差异，并且MOI为100和200时，细胞增殖抑制率分别为3%和10.5%，Ad5/F35-XAF1组细胞增殖抑制率明显低于相应Ad5/F35-NULL组（P＜0.05），其中转染Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-NULL两组A549细胞增殖抑制率测算均以A549原代细胞为标准（图2）。

2.3 细胞凋亡率检测情况将A549原代细胞、转染Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-NULL三组细胞培养48 h后，Annexin V-FITC/PI双染法于流式细胞仪上机检测。结果显示，A549原代细胞、Ad5/F35-NULL及Ad5/F35-XAF1三组中A549细胞早期凋亡率分别为3.2%、6%和15%。与Ad5/F35-NULL及A549原代细胞两组相比，Ad5/F35-XAF1转染组中A549细胞早期凋亡率明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

2.4 凋亡相关蛋白的表达 Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-NULL分别转染肺腺癌A549细胞48 h后，用Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达。与对照病毒相比，Ad5/F35-XAF1组的A549细胞中PARP、Caspase-3和Caspase-8蛋白出现明显裂解条带，显示Caspase依赖途径的凋亡通路活化（图4）。

3 讨论

XAF1是运用酵母杂交法发现的一种新型XIAP拮抗蛋白，可直接与XIAP结合并抑制其抗凋亡作用[5,6]，并发现XAF1对凋亡抑制家族IAPs家族有普遍的抑制作用[7]。本课题组已有的研究[4]表明，XAF1在人肺鳞癌组织中的表达明显低于正常肺组织，且XAF1低表达的程度与肺鳞癌患者的肿瘤分期、病理分级、肿瘤浸润、淋巴结转移等密切。其他研究也发现，通过腺病毒介导的XAF1能恢复XAF1基因在胃癌[3]、结肠癌[8]等消化系统肿瘤细胞中表达甚至过表达，且能抑制细胞增殖促进细胞凋亡。

作为重要的肿瘤抑制因子之一，XAF1在人食管癌[9]、肺癌[4]、胃肠癌[10]等多种肿瘤组织中的表达明显低于正常组织，且与肿瘤的分期、分级相关，但其在肺腺癌A549中抑制肿瘤细胞生长的机制尚不明确。本研究以重组腺病毒为载体，恢复XAF1基因在肺腺癌A549细胞中的表达，用PCR及Western blot方法均提示XAF1表达明显增加，而对照病毒Ad5/F35-NULL组中XAF1表达低下（图1）。用MTT法检测Ad5/F35-XAF1对A549细胞活力的影响，结果提示Ad5/F35-XAF1组中其细胞活力较相同MOI值的对照空病毒Ad5/F35-NULL明显降低（图2）。流式细胞学结果显示，恢复XAF1在A549细胞中的表达后可明显诱导该肿瘤细胞凋亡（图3）并且凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8和PARP的裂解条带明显增加（图4），表明XAF1基因诱导A549细胞凋亡的途径主要通过Caspase依赖的凋亡信号通路。Liston等[11]研究发现，XAF1与XIAP结合后定位于细胞核，它通过竞争性抑制XIAP对Caspase-3抑制作用以激活Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9的活性，从而诱导肿瘤细胞的凋亡，我们的研究证实了他的部分研究结果。

图1 重组腺病毒感染后A549细胞中XAF1 mRNA（A）和蛋白（B）的表达明显增强Fig 1 After infecting by recombinant adenovirus, the expression of mRNA (A) and protein (B) of XAF1 gene increased significantly in A549 cell line

图2 XAF1高表达明显抑制了A549细胞的增殖Fig 2 The higer expression of XAF1 gene inhibited A549 cell proliferation significantly

图3 Annexin V-FITC/PI双染法检测A549细胞凋亡率。A：原始图；B：统计柱状图。Ad5/F35-XAFl转染组中A549细胞早期凋亡率明显增高。Fig 3 Apoptosis rate of A549 detected with Annexin V-FITC/PI staining method. A: Raw data; B: Statistical histogram. Early stage apoptosis rate of A549 cell line increased significantly in the Ad5/F35-XAF1 transfected group.