rs1333049多态性与汉族人群多囊卵巢综合征的相关性研究

张 文，王彬彬，王 晶，陈蓓丽，徐玉萍，曹云霞

rs1333049多态性与汉族人群多囊卵巢综合征的相关性研究

张 文1，王彬彬2，3，王 晶4，陈蓓丽1，徐玉萍1，曹云霞1

目的 了解单核苷酸多态性位点（SNP）rs1333049与多囊卵巢综合征（PCOS）的关系。方法 采用以睾酮激素水平配对的患者作为对照者进行研究，对139例PCOS患者及141例对照者进行研究。采用实时荧光PCR TaqMan探针方法对INK4区域反义非编码 RNA（ANRIL）的一个SNPrs1333049进行基因分型分析。结果 在PCOS患者中，各项生化指标和临床表现在各基因型之间差异无统计学意义。PCOS患者和对照者间基因型分布和等位基因频率差异无统计学意义（χ2=1.87，P=0.17;χ2=3.25，P=0.20）。结论 染色体9p21上rs1333049多态性与PCOS高雄激素患者无关。

多囊卵巢综合征;ANRIL;rs1333049;中国汉族

曹云霞，女，主任医师，教授，博士生导师，责任作者，E－mail:caoyunxia6@126.com

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是较为常见的内分泌系统紊乱的疾病，在育龄期妇女中发病率为5% ～10%［1－2］。根据美国生殖医学协会/欧洲社会人类生殖和胚胎学会鹿特丹标准，PCOS的诊断必须至少符合以下条件中的两个:①稀发排卵或无排卵;② 高雄激素血症或高雄激素的临床表现（如多毛、痤疮等）;③ 超声提示多囊卵巢［3］。在不同表型的PCOS患者中，雄激素过多都是心血管疾病的风险因素［4］。INK4区域反义非编码RNA（antisense non coding RNA in the INK4 locus，ANRIL）位于染色体9p21，且因其与心血管疾病发生的可疑作用而得到突显［5］。有研究［6］提示染色体9p21上某区域内存在有风险的单体型对于欧洲人群的心血管疾病中起到重要作用，其中就包括了rs1333049这一单核苷酸多态性位点。该研究旨在评估染色体9p21上代表性多态性位点rs1333049［7］与中国汉族人群中患有多囊卵巢综合征的患者之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取280名妇女分为两组:PCOS患者组及对照组。根据美国生殖医学协会/欧洲社会人类生殖和胚胎学会鹿特丹标准，共识诊断PCOS患者139例。诊断标准如下:①月经稀少;黄体生成素（luteinizing hormone，LH）/卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）≥2;② 高雄激素血症，血总睾酮（Total testosterone，TT）＞2.8 nmol/L;③ 超声提示多囊卵巢。对照组141例女性有正常月经周期，正常的FSH、LH、TT生化检查结果，并且没有PCOS症状或任何其他类型的慢性无排卵疾病。患者来源于在医院生殖医学中心就诊的不孕症患者。本研究经医院伦理委员会批准，并获得患者知情同意及签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 一般资料的采集 采用统一的调查问卷，了解研究对象的一般资料和临床资料，如年龄、月经史、婚育史等。

1.2.2 生化指标的检测 内分泌激素测定:抽血时间为早卵泡期即月经周期的第5～7天，闭经者无时间限制，取空腹静脉血用放射免疫法测定雌二醇（estradiol，E2）、孕激素（progesterone，P）、睾酮（testosterone，T）、FSH、LH、血清泌乳素（plasma prolactin，PRL）。

1.2.3 基因型分析 基因序列信息来自Hapmap数据库。实时定量荧光PCR反应体系为10 μl，基因组 DNA 1μl，5 μl 2 × TaqMan Universal PCR Master Mix，3.5 μl双蒸水和0.5 μl 20 ×Assay Mix。反应条件为:60℃ 30 s，95℃预变性10 min，95℃ 10 s，60℃ 1 min，共40个循环。基因分型分为 GG、CG、CC型。检测仪器为StepOne PCR real time Sys－tem（美国ABI公司），分析软件为SDS software 2.0（美国ABI公司）。每个检测单元均设立阴性对照。

1.3 统计学处理 应用SPSS 10.0软件进行统计分析，PCOS患者组和对照组间基因型和等位基因频率差异（计量资料）比较运用χ2检验，PCOS患者组和对照组临床资料间（组间）差异运用t检验。

2 结果

2.1 一般资料 PCOS患者组和对照组FSH和LH水平比较差异有统计学意义（P＜0.05）。PCOS患者组与对照组比较更具有发生心血管疾病风险因子，如 T水平和身体质量指数（body mass index，BMI）值（P＜0.05）。见表1。

表1 PCOS患者组与对照组临床资料比较（±s）

表1 PCOS患者组与对照组临床资料比较（±s）

项目 患者（n=139） 对照（n=141） P值年龄（岁） 25.73±3.8（17～35）29.79±3.6（23～40）＜0.01初潮年龄（岁） 15.0±2.2 14.49±1.3 0.23 BMI 23.00±5.0 21.66±2.9 ＜0.01身高 （cm） 160.0±4.9 160.23±5.2 0.15体重 （kg） 60.3±13.0 55.55±7.5 ＜0.01 E2（pmol/L） 257.99±173.1 156.05±75.9 ＜0.01 FSH（IU/L） 3.97±1.2 6.90±1.4 ＜0.01 LH（IU/L） 11.26±3.26 5.56±2.20 ＜0.01 PRL（ng/ml） 79.45±53.5 21.69±27.7 0.17 T（nmol/L）3.47±0.8 1.08±0.6 ＜0.01

2.2 基因型分析

2.2.1 TaqMan探针基因分型图 结果见图1。

图1 rs1333049位点3种基因型的TaqMan探针结果

2.2.2 基因型及等位基因频率 PCOS患者组与对照组间基因型分布和等位基因频率差异无统计学意义（χ2=1.87，P=0.17;χ2=3.25，P=0.20）。见表2。

3 讨论

PCOS不仅是一个生殖障碍疾病，同时也是一种可能长期影响妇女健康的代谢性疾病。根据鹿特丹标准PCOS表型得到扩展，包括有高雄激素表现的正常月经周期妇女和无雄激素过高的月经周期不规律的妇女。最近根据鹿特丹标准评估不同PCOS表型的内分泌指标，有高雄激素血症表现的所有表型都有腰围增加和胰岛素抵抗，而有多囊卵巢形态的无排卵非高雄激素血症的患者与对照比较却无此趋势。这就带来一个新的问题，这些新的PCOS表型是否存在代谢紊乱，甚至增加罹患糖尿病或心血管疾病的风险。同时，循环内的内源性雄激素在代谢改变，以及PCOS患者和健康女性体内的心血管系统中的作用仍不清楚。在部分同样的样本中检测出过早动脉粥样硬化升高的血清标志物，如C反应蛋白和同型半胱氨酸以及内皮功能障碍。PCOS患者是早发心血管疾病高风险的最大群体［8］。近期文献［9］报道有增厚的颈动脉内膜厚度（intima－media thickness，IMT）的 PCOS患者相较于健康对照者而言动脉粥样硬化倾向性明显增加，而IMT可通过无创检查对潜在的血管疾病进行评价。基于已知的心血管代谢的风险因子，PCOS患者心血管疾病的风险较正常女性高出5～7倍［10］。

表2 PCOS患者组和对照组中rs1333049（C/G）基因型和等位基因频率［n（%）］

染色体9p21上这个区域含有编码2个细胞周期依赖激酶抑制因子—CDKN2A和CDKN2B基因的编码序列。这两个基因在细胞周期调节中起重要作用，并且可能通过其在转化生长因子（TGF）－β诱导生长抑制中的作用参与到动脉粥样硬化的病理过程中［11－12］。有报道［13］称染色体 9p21 上 ANRIL 参与到CDKN2B－p16/CDKN2Ap14细胞周期基因簇的调节。rs1333049多态性是与疾病相关因子中联系最强的。有前期研究［7］证实rs1333049与多种心血管疾病之间存在相关性。然而，在PCOS患者组与对照组间rs1333049位点基因型分布与等位基因频率并无显著性差异;致使无法确定两者之间的联系。在心血管疾病病理发生过程中有多种风险因子参与，而在实验中PCOS患者的高T水平并不是心血管疾病发生的唯一病因。本研究收集病例均来自生育年龄妇女，而心血管疾病的发展则需要长时间的过程，这有可能是另一个导致实验无法在PCOS和心血管疾病间建立联系的原因。尽管绝经后卵巢不能芳香化，但依然可以持续产生雄激素，所以绝经效应在循环内雄激素水平改变上并不是很明显。高雄激素血症在中年持续的程度可能决定有PCOS病史的老年妇女罹患心血管疾病的风险程度。

本研究是首次观察rs1333049在有高雄激素血症的PCOS患者身上发挥的作用。结果显示rs1333049多态性位点可能与中国汉族人群中PCOS患者无明显相关性。需要其他大样本例数的实验，以求进行更深入的研究，更真实地反映群体的情况。

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An association study of rs1333049 polymorphism with polycystic ovarian syndrome in Chinese Han population

Zhang Wen1，Wang Binbin2，3，Wang Jing4，et al
（1Dept of Reproductive Medicine Center，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022;2Center for Genetics，National Research Institute for Family Planning，Beijing100081;3Peking Union Medical
College，Beijing100730;4Dept of Medical Genetics，Capital Medical University，Beijing100069）

ObjectiveTo investigate the association between rs1333049 polymorphism and the risk of polycystic ovarian syndrome（PCOS）in Chinese population.Methods139 PCOS patients and 141 healthy control were divided in two groups by the level of testosterone.The TaqMan real time PCR technique was used to detect the genotypes of a single nucleotide polymorphism rs1333049 in ANRIL from the samples.ResultsIn PCOS women，no significant differences in endocrine clinical and biochemical variables were found between the genotypes.There was no significant difference in genotype distributions and allele frequencies for rs1333049 between PCOS patients and controls.（χ2=1.87，P=0.17;χ2=3.25，P=0.20）.ConclusionThis study demonstrates no association of rs1333049 polymorphism locus on chromosome 9p21 with the risk for PCOS in Han Chinese.

polycystic ovarian syndrome;ANRIL;rs1333049;Chinese Han population

R 588.6

A

1000－1492（2014）05－0622－03

2013－12－10接收

国家“973”项目（编号:2012CB944704）;高等学校博士学科点专项科研基金（编号:20093420110001）

1安徽医科大学第一附属医院妇产科生殖中心，合肥230022

2国家人口计生委科研所遗传室，北京 100081

3中国协和医科大学，北京 100730

4首都医科大学医学遗传室，北京 100069

张 文，女，硕士研究生;