卵黄替代血清检测产蛋鸭高致病性禽流感免疫抗体水平的可行性研究
2014-09-07，，
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(宁波市江北区畜牧兽医站，浙江宁波 315020)
卵黄替代血清检测产蛋鸭高致病性禽流感免疫抗体水平的可行性研究
范文颖，周寅，顾祥国
(宁波市江北区畜牧兽医站，浙江宁波 315020)
为探讨以卵黄替代血清检测产蛋鸭高致病性禽流感免疫抗体水平的可行性，对小群体试验鸭，每隔7 d采集卵黄样品和对应的血清样品，持续3个月，以HI方法检测两者高致病性禽流感病毒疫苗(H5 RE-6株)免疫抗体水平，对检测结果进行差异性及相关性研究。结果表明，卵黄与对应的血清免疫抗体水平差异不显著，具有较强相关性。同时进行田间大样本检测，从30家蛋鸭养殖户每家随机采集30枚蛋和20份全血样品，对检测结果进行kappa检验，表明卵黄和血清对判定群体免疫抗体水平具有一致性。
卵黄；禽流感；免疫抗体；蛋鸭
我国规定对养殖禽类的高致病性禽流感实行强制免疫，检测高致病性禽流感免疫抗体是基层动物防疫监督部门的重要工作。一般通过检测禽类血清中高致病性禽流感抗体水平，进行免疫效果评估。这种方法在采血时必须对家禽进行抓捕、穿刺抽血等操作，易对蛋禽造成惊吓等应激而引起群体性产蛋量降低，使养殖户蒙受经济损失，养殖户普遍不愿配合，且费时费力，采样效率不高。
本研究使用经筛选后的鸭卵黄禽流感抗体检测方法(效价与血清抗体较一致)对小群体试验鸭和田间样本的卵黄分别进行卵黄抗体效价检测，并与血清抗体效价进行相关性和一致性检验，以确定用检测卵黄抗体代替血清抗体对产蛋鸭进行高致病性禽流感免疫评估的可行性。
1 试验材料
1.1 疫苗 重组二价禽流感病毒灭活疫苗(H5+H9亚型)。批号：2012043，乾元浩生物股份有限公司郑州生物厂生产。
1.2 HI试验用抗原和血清 高致病性禽流感病毒(H5N1亚型RE-6株)抗原和血清。哈尔滨维科生物技术开发公司生产，批号为20130218。
1.3 试验动物
1.3.1 从宁波江北区某种鸭场选取个体差异不显著的产蛋鸭20羽(180日龄)，经H5N1禽流感疫苗三次免疫，放入试验鸭舍采用常规方法饲养，作为小群试验鸭。
1.3.2 宁波市江北区30家存栏蛋鸭2000羽以上蛋鸭场中的产蛋鸭群(绍兴麻鸭)，每家随机采集蛋30枚和全血样品20份，进行田间大样本检测。
1.4 仪器及试剂 96孔V型微量反应板、微量移液器、漩涡震荡器、微量振荡器、离心机、无菌采血器等及1%鸡红细胞悬液，生理盐水。
2 试验方法
2.1 样品采集 试验蛋鸭于180日龄(产蛋稳定)开始采样，每隔7 d采集1次血清，每天收集鸭蛋，采血当天产蛋作为检测用蛋(20枚)。试验期3个月，至260日龄左右结束，共采样12次。
田间大样本采自30家蛋鸭养殖场，每场随机采集当天产的鸭蛋30枚和全血样品20份，编号记录，要求按场户对应。
2.2 样品制备
2.2.1 血清样品制备 无菌采集蛋鸭翅或肢静脉血，静置后吸取析出血清。保存待检。
2.2.2 卵黄样品制备 将卵黄与蛋清分离，用无菌采血器刺破卵膜，直接从卵黄囊抽取卵黄。将采集的卵黄与等量生理盐水作1∶1稀释，混合制成卵黄检样备用。
2.3 HI抗体效价测定 血清样品按《GB/T 18936-2003高致病性禽流感诊断技术》规定方法检测。卵黄生理盐水稀释样品参照血清样品进行HI效价测定。
3 结果与分析
3.1 小群体试验鸭卵黄与血清HI抗体效价的差异性比较 详见表1。
表1 小群体试验鸭卵黄与血清HI抗体效价结果
由表1可见，在单独笼养试验点的240组蛋鸭卵黄与对应血清HI抗体效价检测中，卵黄与血清抗体滴度相差在±1log2以内的有230组，符合率在95%以上。利用spss12.0软件对12批次的数据进行t检验，差异不显著(t
3.2 小群体试验鸭卵黄—血清抗体效价消长规律及相关性分析 详见图1。
图1 小群体试验鸭卵黄与血清HI抗体效价结果
由图1可见，试验期间卵黄与血清抗体效价均值较为接近，同升同降，曲线变化较为一致，利用spss12.0软件进行相关系数分析(r=0.63>r0.05，P<0.05)，表明两者具有强相关性。
在整个试验期间，卵黄和血清抗体效价均维持在较高水平(>5log2)，表明经过三免高致病性禽流感疫苗后的有效抗体维持水平可达260日龄后，基本覆盖了整个产蛋期。
3.3 田间大样本检测对两种方法的一致性检验 详见表2。
表2 田间大样本检测卵黄与血清抗体阳性率检测结果
由表2可见，以阳性率70%以上作为群体免疫合格标准，对30家养殖场数据进行整理归类，经一致性kappa检验(k=0.782>0.75)，表明在不同产蛋期间用卵黄抗体的阳性率评估蛋鸭群体免疫合格与血清评估具有良好的一致性。
4 结果与讨论
不少国内学者对卵黄抗体效价与血清抗体效价的相关性进行过初步研究，孟艳等(2007)[1]、席文平等(2007)[2]研究均认为蛋鸡卵黄抗体效价与血清效价的差异不显著，具有相关性。但有关蛋鸭卵黄与血清抗体相关性研究报道甚少，本研究可为卵黄取代血清作为蛋鸭禽流感抗体检测样本提供了依据。
实际操作中，卵黄样品需经制备才能用HI方法检测。研究者利用很多方法对卵黄样品进行提纯制备，如氯仿萃取法[3]、PBS直接稀释法[4]、PEG沉淀法[5]。从抗体检测简便实用角度出发，笔者经过筛选，采用生理盐水直接稀释卵黄样品，检测效价与血清效价差异不显著，且重复性良好。
据黄建文等(2004)[6]报道，在蛋鸡禽流感疫苗免疫后的21 d内不适宜采用卵黄替代血清监测禽流感抗体，因为卵黄中抗体产生较血液中抗体产生滞后。但在养殖户实际饲养过程中，很少在产蛋期间进行免疫接种，一般均在开产前1个月就已做好三免工作。因此，在实际检测工作中无论在产蛋初期、中期、还是后期，均可采用卵黄替代血清检测禽流感抗体。
本次试验利用统计学方法对小群体试验鸭的卵黄与对应血清的免疫抗体效价进行分析，发现两种抗体效价差异不显著，具有较强相关性，可以用卵黄替代血清进行检测。田间大样本检测结果表明，在不同产蛋期间实际操作中卵黄和血清对判定群体免疫水平具有一致性，再次验证了在产蛋期可以采用卵黄替代血清样品进行检测。
[1]孟艳，杨秀女，武秋双，等.蛋禽卵黄和血清禽流感抗体的差异及相关性[J].今日畜牧兽医，2007,6:3-5.
[2]席文平，李吉轩，岳建新，等.禽流感血清抗体与卵黄抗体消长规律比较研究[J]．中国畜牧兽医，2007，34(1)：103-105.
[3]郑立勇，乔彦良，马凤龙. 卵黄抗体不同提取方法的比较[J].动物保健品，2009,1:106-107.
[4]康亦兼，咸漠，李文兴，等.水稀释法分离卵黄IgY[J].吉林大学自然科学学报，2001,3：84-86.
[5]闵嗣璠，李彬，万思平.PEG6000用于卵黄抗体提取条件的初探[J].食品科学，2007，11(28)：241.
[6]黄建文，毛跟年，马秋明，等.蛋鸡血清与卵黄中禽流感病毒抗体的相关性[J].中国兽医科技，2004,34(5):65-67.
2014-01-15
S858.32
：A
：1005-7307(2014)03-0006-003
