姜黄素诱导恶性黑色素瘤细胞凋亡及对AIFM2基因表达的影响

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(上海交通大学附属第六人民医院 整形外科，上海 200233 )



·实验研究·

姜黄素诱导恶性黑色素瘤细胞凋亡及对AIFM2基因表达的影响

邓辰亮，郑江红，万伟东，杨波，茅广宇，刘斌，杨松林*

(上海交通大学附属第六人民医院 整形外科，上海 200233 )

目的 明确姜黄素诱导恶性黑色素瘤细胞系A375凋亡的作用，探讨姜黄素作用机制。方法 A375细胞系经5～20 μmol/L姜黄素作用48 h后, MTT法测定细胞增殖能力；流式细胞仪检测细胞凋亡;RT-PCR方法检测细胞AIFM2及p53 mRNA的表达。结果 0、5.0、10.0、20.0 μmol/L姜黄素作用A375细胞48 h后细胞增殖抑制率分别为1.1%±0.3%、14.9%±5.9%、21.6%±4.7%、41.5%±5.4%;凋亡所占的百分比分别为3.5%±1.8%、17.1%±7.8%、23.8%±6.0%、33.6%±4.4%；AIFM2基因mRNA表达相对比值为(0.6±0.2)、(0.8±0.2)、(1.0±0.4)、(1.2±0.5)；p53 mRNA表达相对比值分别为(0.9±0.4)、(1.1±0.4)、(1.2±0.5)、(1.3±0.4)。各组之间均存在统计学意义(P<0.05)。伴随姜黄素作用浓度的升高,A375细胞的生长被显著抑制。AIFM2 mRNA与p53 mRNA表达显著上调。结论 姜黄素可能通过上调AIFM2基因的表达促使黑色素瘤细胞凋亡。

恶性黑色素瘤;姜黄素;AIFM2基因;凋亡

姜黄素(curcumin)是从中药姜黄根茎提取的二酮类色素[1]。具有抗肿瘤、抗感染等作用[2-6]。且对恶性黑色素瘤细胞有明显的促凋亡作用[7]。本研究通过观察姜黄素诱导恶性黑色素瘤A375细胞系凋亡过程中AIFM2基因的变化,探索其作用机制，为治疗恶性黑色素瘤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人恶性黑色素瘤细胞系A375(以下简称为A375)购于中科院上海细胞所；姜黄素(使用时用DMEM培养液稀释至所需浓度)、四氮唑溴盐(MTT)和AnnexinV/PI双标试剂盒均购自美国Sigma公司；DMEM培养基(美国Gibco公司)；10%小牛血清(美国Hyclone公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖活力检测 将104个/mL的A375细胞接种于96孔板，37 ℃、5%CO2培养24 h后，分别使用5.0、10.0、20.0 μmol/L的姜黄素处理，计算细胞增殖抑制率。

1.2.2 细胞凋亡分析 根据Annexin V/PI双标试剂盒说明,调整细胞浓度为5×105/mL。用流式细胞仪分析。采用Cellquest软件分析结果。

1.2.3 AIFM2及p53 mRNA表达检测 采用RT-PCR法。收集目的A375细胞提取细胞总RNA，取0.5 μg RNA进行反转录，以反转录合成的cDNA为模板，进行PCR反应。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，Quantity One系统进行灰度分析。

1.2.4 统计学方法 应用SPSS 19.0软件统计分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 姜黄素对A375细胞增殖活力影响 5.0 μmol/L姜黄素对A375细胞增殖抑制率为14.9%±5.9%，10.0 μmol/L抑制率为21.6%±4.7%，20.0 μmol/L抑制率为41.5%±5.4%，对照组抑制率为1.1%±0.3%。各组之间均存在统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 姜黄素对A375细胞增殖抑制统计分析

2.2 Annex in V/PI检测细胞凋亡 5.0、10.0、20.0 μmol/L姜黄素分别作用A375细胞48 h后，凋亡所占的百分比分别为，17.1%±7.8%，23.8%±6.0%，33.6%±4.4%，对照组为3.5%±1.8%。各组之间均存在统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 姜黄素影响A375细胞凋亡率的统计分析

2.3 姜黄素对A375细胞AIFM2和p53 mRNA 转录水平影响 0、5.0、10.0、20.0 μmol/L姜黄素作用A375细胞48 h后AIFM2 mRNA表达相对值分别为(0.6±0.2)、(0.8±0.2)、(1.0±0.4)、(1.2±0.5)；p53 mRNA表达相对值分别为(0.9±0.4)、(1.1±0.4)、(1.2±0.5)、(1.3±0.4)。各组比较有统计学意义(P<0.05)。见图3～图4。

图3 p53 mRNA和AIFM2 mRNA表达电泳结果

图4 p53 mRNA和AIFM2 mRNA表达统计结果

3 讨论

恶性黑色素瘤的恶性程度极高，常隐匿发生，且对放化疗不敏感，治疗难度大。姜黄素既能促进肿瘤细胞凋亡又能抑制肿瘤细胞转移[2,4-5]。国内外研究者[6-7]也就姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡进行了大量的研究。然而，其机制仍不清楚。

AIFM2(apoptosis-inducing factor,mitochondrion-associated，2)作为凋亡诱导因子基因，编码黄素蛋白氧化还原酶，使其与DNA单链发生于与序列无关的结合,促进细胞凋亡。在多数人体肿瘤组织中AIFM2基因表达下调[8]。本研究中，笔者发现，未诱导组中A375细胞AIFM2基因的表达相对较低，经过姜黄素诱导48 h后，A375细胞AIFM2基因表达明显上调，细胞凋亡率也明显增加。重要的是AIFM2基因促进肿瘤细胞凋亡不依赖于caspase所介导的细胞经典凋亡途径[9]。因此，本研究提示，姜黄素可能能通过多途径诱导A375细胞凋亡。

P53基因是人类发现的与肿瘤高度相关性的基因之一。野生型P53基因是一种抑癌基因，而导致肿瘤发生的P53基因则为突变型。在多数肿瘤中发现的高表达P53蛋白也是P53基因突变的产物。本研究中，经过姜黄素诱导后黑色素瘤细胞，笔者发现AIFM2基因上调的同时p53基因表达也上调。而另据报道AIFM2基因在结肠癌细胞中被p53/TP53诱导4 h后可发生明显的表达上调。因此，AIFM2基因表达的改变究竟来源于姜黄素直接作用，还是通过p53基因上调后的间接作用，还有待今后的实验研究。笔者在研究中发现,姜黄素作用后A375细胞AIFM2 mRNA表达明显升高，而且AIFM2 mRNA表达与姜黄素浓度呈明显的量效依赖关系。由于AIFM2分子所介导的线粒体性细胞凋亡不依赖caspase分子[9]。因此，姜黄素不仅可以通过活化caspase分子促进肿瘤细胞凋亡，也可以通过不依赖caspase分子的线粒体性途径凋亡。这一发现在国内外尚未见报道。综上所述，姜黄素作为一种具有潜在应用价值的预防与治疗肿瘤的药物，通过抑制肿瘤细胞增殖，以及加强AIFM2与p53基因的表达加速黑色素细胞凋亡，为治疗恶性黑色素瘤提供了另一条可能的途径。

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AIFM2geneexpressionandapoptosisinducedbycurcumininhumanmalignantmelanomacellline

DENG Chenliang,ZHENG Jianghong,WAN Weidong,YANG Bo,MAO Guangyu,LIU Bin,YANG Songlin*

(Department of Plastic Surgery,The 6th People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200233,China)

ObjectiveTo explore the mechanism and effect of curcumin on human malignant melanoma cell line A375 apoptosis.MethodsA375 cell line were treated by 5～20 μmol/L curcumin.Cell proliferation was measured by MTT.Apoptosis was detected by flow cytometry.RT PCR was used to detect AIFM2 and p53 mRNA expression.ResultsThe cellular proliferation inhibition rates of 0,5.0,10.0,20.0 μmol/L curcumin on A375 cell were 1.1%±0.3%、14.9%±5.9%、21.6%±4.7%、41.5%±5.4% after 48 hours.The percentages of apoptosis were 3.5%±1.8%、17.1%±7.8%、23.8%±6.0%、33.6%±4.4%.The relative ratios of AIFM2 gene mRNA were (0.6±0.2)、(0.8±0.2)、(1.0±0.4)、(1.2±0.5).The relative ratios of p53 mRNA expression were (0.9±0.4)、(1.1±0.4)、(1.2±0.5)、(1.3±0.4).There are significant differences among these groups (P<0.05).The growth of A375 cell was significantly inhibited with the increase of the concentration of curcumin.AIFM2 mRNA and p53 mRNA expressions were significantly increased.conclusionsCurcumin can increase AIFM2 gene expression to accelerate the apoptosis of melanoma cells.

malignant melanoma;curcumin;AIFM2;apoptosis

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.01.004

国家自然科学基金(81000837)。

邓辰亮(1976-)，男，博士，主治医师。研究方向：黑色素瘤治疗。

] 杨松林，电子信箱slyang@sjtu.edu.cn。

R285.5

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2095-6258(2014)01-0009-03

2013-09-26)

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