高分辨率熔解曲线法在BIM基因2,903 bp片段插入/缺失检测中的应用

夏金晶 白浩 熊丽纹 李蓉 颜波 邵敏华 韩宝惠

BIM基因是编码细胞凋亡基因BCL2蛋白家族中的一个成员，在细胞凋亡中发挥重要的调节作用[1,2]。研究[3]表明BIM基因外显子3和外显子4之间存在的2,903 bp的缺失会造成BIM亚型BH3结构缺乏表达。而这种缺乏表达会导致癌症患者对部分治疗药物有更强的耐药性。在癌症患者体内，这种删除与药物反应的持续时间相关联，并且能够被用来预测患者在没有疾病恶化时的存活时间。携带这种删除突变的那些患者的平均无疾病恶化存活期限为大约6个半月时间，而没有这种突变的那些患者则为将近12个月。因此BIM缺失的检测对于癌症患者有相当重要的意义。

在本研究中，建立了一种高分辨率熔解曲线法（high resolution melting, HRM）来检测BIM基因片段缺失在肺癌患者中的发生情况，并用传统PCR方法对HRM检测结果进行验证。结果表明，建立了一种高分辨率熔解曲线法对于BIM基因2,903bp片段插入/缺失检测是一种灵敏、准确、快速、高通量的方法。

1 材料与方法

1.1 病例样本 共检测30例肺癌样本。30例正常对照样本。其中30例肺癌样本来自于上海市胸科医院2012年8月-2013年8月入院治疗的晚期非小细胞肺癌患者（IIIa期-IV期）。患者签署知情同意书后，抽取5 mL外周血，使用EDTA抗凝管进行保存。30例正常对照样本来自上海市徐汇区社会体检人群，俱签署知情同意。

1.2 DNA提取 基因组DNA采用浓盐法[4]进行抽提。取200 μL全血放入1.5 mL离心管内，加入裂解液STE（Tris-Hcl 10 mM, NaCl 20 mM, EDTA 1 mM）410 μL，10%SDS 90 μL，pk 5 μL在65oC消化15 h左右。充分消化后加入300 μL饱和NaCl轻摇3 min。加氯仿340 μL混匀后12,000 rmp离心20 min。将上清液吸入另一离心管中，加异丙醇650 μL，4oC，12,000 rpm离心16 min。倒掉异丙醇加500 μL 75%乙醇，4oC 12,000 rpm离心5 min，重复两次后烘干沉淀，加入70 μL Mili Q水溶解。提取的基因组DNA经Nanodrop定量，测定260/280值后，冻存备用。

1.3 引物设计与合成 根据GenBank中人类BIM基因序列（Gene ID: 10018），设计HRM上游引物：ATACCATCCAGCTCTGTCTTCATAG，HRM下游引物1：CCCAACCTCTGACAAGTGACC，HRM下游引物2：TTGGTGGGAATGTAAAATGGC。HRM引物设计原理见图1。普通PCR上游引物：AATACCACAGAGGCCCACAG ，普通PCR下游引物：GCCTGAAGGTGCTGAGAAAG。测序上游引物：CATAAATACCACAGAGGCCCACA GC，测序下游引物1：CCCAACCTCTGACAAGTG ACC，测序下游引物2：TTGGTGGGAATGTAAA ATGGC。

1.4 HRM检测 PCR扩增和高通量熔解曲线分析在LightCycler® 480 II 荧光定量PCR仪（Roche）上进行，采用384孔反应模块。试剂使用LightCycler® 480 High Resolution Melting Master试剂盒，反应体系为10 μL，内含5 ng-10 ng基因组DNA、1×Master Mix、3.0 mmol/L MgCl2，引物浓度为0.2 μmol/L。

PCR扩增采用降落（touchdown）模式：95oC预变性10 min，95oC变性15 s，65oC-55oC退火（每循环下降0.5oC）15 s，72oC延伸20 s的程序进行20个循环。之后再按95oC变性15 s，55oC退火15 s，72oC延伸20 s的程序进行25个循环。扩增产物的熔解步骤在PCR循环结束后立即进行，程序为：升温至95oC 15 s，然后降温至40oC 1 min，再升温至65oC 1 s。从65oC连续升温至95oC的过程中进行荧光收集（20次/oC）。最后，降温至40oC。高分辨率熔解曲线分析用LightCycler® 480的Gene Scanning软件（1.5 version）进行。

2 结果

2.1 HRM检测方法的建立与优化 根据BIM基因缺失情况与序列信息，设计相应的引物。同一个反应中存在两对引物，可能扩增出两种不同的产物。为使两种产物都得到较好的扩增，采取了降落（touchdown）模式对模板进行扩增。缺失型模板的扩增产物与野生型模板扩增产物相比GC含量略低，解链温度也较低。分析结果显示，野生型和缺失型的模板所产生的熔解曲线可见明显差异，相应的Tm值相差约2.5oC（图2）。在HRM的灵敏度检测中，分析评估不同BIM突变浓度DNA的结果（ 0%、1%、2%、5%、10%、25%、50%稀释和100%的突变体）。该HRM方法可以很容易区分突变含量为5%的样本（图3） ，比普通PCR以及直接测序更高 。

2.2 30例肺癌样本、30例正常对照样本BIM基因缺失检测结果 应用建立的HRM检测法，对30例肺癌样本，30例正常对照样本进行BIM基因缺失检测。在30例肺癌样本中发现纯合缺失型样本1例，杂合样本7例，其余均为野生型样本；在30例正常对照样本中发现杂合样本2例，其余均为野生型样本。从以上纯合缺失型、杂合缺失型、野生型样本中各取2例进行测序和普通PCR鉴定，普通PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析。

代表性的野生型、杂合缺失型和纯合缺失型的HRM与普通PCR检测结果如图4所示，测序结果如图5所示。图4、5中a标本检测为野生型，b标本检测为杂合缺失型，c标本检测为纯合缺失型。

3 讨论

图 1 HRM检测BIM基因缺失引物设计原理Fig 1 The principle of the HRM detection BIM gene deletion‘s primer design

图 2 野生型比缺失型的解链温度要高。经变换后的熔解曲线峰值温度差值约为2.5 ℃，区分十分明显（——野生型——缺失型）。Fig 2 The melting temperature of wild-type is higher than the deletion. Ater the data processing the significant difference of the melting curve peak temperature is about 2.5 ℃ (——wild type——deletion).

图 3 HRM检测BIM缺失灵敏度检测。1: 0%；2: 50%；3: 25%；4: 10%；5:5%；6: 1%；7: 100%。Fig 3 Sensitivity of the high resolution melting (HRM) analysis for detecting the BIM deletion. 1: 0% mutant; 2: 50% mutant; 3: 25%mutant; 4: 10% mutant; 5: 5% mutant; 6: 1% mutant; 7: 100%.

图 4 代表性野生型、杂合缺失型和纯合缺失型的HRM与普通PCR检测结果Fig 4 The typical results of the the wild-type, heterozygous and homozygous' HRM and ordinary PCR detection

图 5 代表性野生型、杂合缺失型和纯合缺失型的测序结果Fig 5 The typical results of the the wild-type, heterozygous and homozygous' sequencing detection

HRM可以检测扩增模板中的序列变化。该方法是通过检测与双链DNA结合的饱和荧光染料在变性升温过程中随着DNA解链时游离到体系中发生的荧光强度的减弱而实现的。与传统PCR以及测序方法相比较，此种方法可以在一步PCR反应中实现，无需延伸、无需进行电泳鉴定，有着快速、简便、重复性好、污染可能低的特性，而且只要是模板中有序列变化，都会使其熔解曲线发生变化，从而在高分辨率溶解曲线去得以体现，比传统PCR以及测序更灵敏[5,6]。

HRM能检测模板中存在的任何序列变化。这使得该方法不但可以检测特定位点的突变，还能筛查整个扩增序列的变化。

BIM基因对细胞凋亡的调节起着极为重要的作用[2,7]，在另外一项研究中发现BIM基因变异导致了某些患者无法受益于这些酪氨酸激酶抑制剂药物。药物耐受主要是BIM突变导致BIM蛋白生成受损。而使用BH3药物修复BIM基因功能就可能克服两种癌症类型的TKI耐受[3]。以上研究表明，BIM是个癌症耐药基因。Ng等[3]的研究中对BIM基因上2,903 bp的indel的检测使用的方法为琼脂糖凝胶电泳方法，和本文阐述的HRM方法相比，凝胶电泳所需时间更长、检测需要开放式进行可能引入污染和交叉污染的机会，同时凝胶成像使用肉眼观察，如果PCR产物浓度较低会导致错误读取。相比，HRM方法使用荧光染料检测，灵敏度更高，原管检测避免了开管检测可能引入的污染机会，PCR反应完成后仅需要5 min-10 min进行熔解曲线检测，更方便快捷。本研究建立的对BIM基因2,903 bp片段缺失的HRM是一种灵敏、准确、高效、快速、低污染的检测方法。