肾炎宁对IgA肾病大鼠尿蛋白和肾脏病理改变的影响

梁建英，陈欣华，王冬玉， 边 东，郭登洲，高 艳(.河北省石家庄市第一医院干部科，河北 石家庄 000；.河北省石家庄市第一医院心内科，河北 石家庄 000；.河北省石家庄市疾病预防控制中心行政科，河北 石家庄 000；.河北省中医院肾病科，河北 石家庄 0007；.河北唐山职业技术学院,河北 唐山 06000)

·论著·

肾炎宁对IgA肾病大鼠尿蛋白和肾脏病理改变的影响

梁建英1，陈欣华2，王冬玉3， 边 东4*，郭登洲4，高 艳5
(1.河北省石家庄市第一医院干部科，河北 石家庄 050011；2.河北省石家庄市第一医院心内科，河北 石家庄 050011；3.河北省石家庄市疾病预防控制中心行政科，河北 石家庄 050011；4.河北省中医院肾病科，河北 石家庄 050017；5.河北唐山职业技术学院,河北 唐山 065000)

目的探讨肾炎宁对IgA肾病大鼠24h尿蛋白和肾脏病理改变的影响，观察该方对IgA肾病的治疗效果。方法将30只健康雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组和肾炎宁组各10只，除正常组外其余各组复制IgA肾病模型。从造模后第9周开始肾炎宁组给予肾炎宁煎剂灌胃，正常组、模型组均灌服等量生理盐水，共给药8周。分别于造模前，造模后第6周末、8周末、12周末、16周末用代谢笼收集24h尿液，行24h尿蛋白定量测定。16周末处死大鼠，留取肾脏组织，观察大鼠肾脏病理改变。结果造模第16周末，肾炎宁组大鼠24h尿蛋白定量较模型组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，与8周末、12周末尿蛋白量比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。光镜下，正常组肾小球结构完整，肾小球系膜、基质未见明显异常改变；模型组可见肾小球系膜细胞增生、系膜基质增多、系膜区增宽、部分肾小管发生空泡变性；肾炎宁组也有不同程度病理改变，但与模型组相比病变减轻。结论肾炎宁能减少IgA肾病大鼠24h尿蛋白定量,减轻肾组织病理损害。

肾小球肾炎，IgA；白蛋白尿;大鼠

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.08.021

IgA肾病又称Berger病，是指肾小球系膜区以IgA或IgA沉积为主的一种原发性肾小球肾炎，临床表现以血尿为主，伴或不伴有蛋白尿，是我国常见的肾小球疾病之一，也是终末期肾衰的主要原因之一,严重危害人们的身体健康。目前认为IgA肾病是导致肾纤维化的主要因素。本研究探讨肾炎宁对大鼠24h尿蛋白及肾组织肾脏病理改变的影响，观察其对IgA肾病的治疗效果，旨在为有效的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物：选取清洁级健康雄性SD大鼠30只(河北省实验动物中心提供)，置于安静的空调房内饲养，室温保持在18～23℃之间，相对湿度保持在45%～55%之间，分装到6只饲养笼中，每日更换垫料，开窗通风。适应性喂养动物1周后用代谢笼留取尿液，用试纸条检测尿蛋白、尿潜血均为阴性，根据体质量排序，随机分为正常组、模型组、肾炎宁组各10只。

1.2 实验药物：受试药物包括黄芪、生地黄、茯苓、党参、白术、白茅根、女贞子、墨旱莲、川芎、三七粉、仙鹤草、甘草，由河北省中医院提供，药物水煎浓缩至含生药3.9g/mL，放入瓶中密闭4℃存放备用，18.7g·kg-1·d-1灌胃。

1.3 主要试剂与仪器：牛血清白蛋白SBA由美国Sigma公司提供。葡萄球菌肠毒素B(staphyloccal enterotoxins B,SEB)由中国军事科学研究院微生物流行病研究所提供。焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)由美国Amresco公司提供。Trizol由北京索莱宝生物科技有限公司提供。异丙醇由天津市博迪化工有限公司提供。琼脂糖由上海GENE生物有限公司提供。匀浆器(JJ-1型定时电动搅拌器)由国华仪器厂提供。Sartorius由电子天平北京赛多利斯天平有限公司提供。水平电泳槽、DYY-12型电脑三恒多用电泳仪均由北京市六一仪器厂提供。医学图像定量分析系统由武汉千屏影像技术有限责任公司提供。新鲜的双蒸水中加入盐酸,浓度为8.5mmol/L，即1 000mL双蒸水中加入10%盐酸3.2mL。1% BSA酸化水的制备,1g BSA加入1 000mL酸化水，4℃保存备用。1% BSA缓冲液的制备，将1g BSA溶于100mL生理盐水中，现用现配。

1.4 造模方法：除正常组小鼠自由饮食水外，其余2组均在其基础上隔日口服含0.1% BSA的酸化水6周,6周后按10mg/kg每日1次定期尾静脉注射1%BSA缓冲液,每周连续3d，于第8周按0.4mg/kg,每周1次,连续3周,复加尾静脉注射SEB。正常组口服及注射同等量生理盐水，于造模第9周开始给药，每日1次，肾炎宁组给予中药煎剂18.7g·kg-1·d-1灌胃，正常组和模型组给予相当剂量的生理盐水灌胃，各组共给药8周。于16周末处死动物。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 24h尿蛋白定量：分别于造模前，造模后第6周末、8周末、12周末、第16周末将大鼠置于代谢笼中，禁食，自由饮水，收集24h尿液，双缩脲法测定24h尿蛋白定量。

1.5.2 光镜样品及免疫组化样品制备：取部分肾皮质，4%多聚甲醛溶液固定，酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成3μm厚的石蜡切片，行六胺银染色，观察肾小球变化。石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2室温孵育5～10min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min×2次，5%～10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10min，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1～2h或4℃过夜，PBS冲洗，5min×3次，滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育10～30min，PBS冲洗，5min×3次，滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的工作液，37℃孵育10～30min，PBS冲洗，5min×3次，DAB显色剂显色3～15min，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

2 结 果

2.1 大鼠的一般情况：正常组大鼠饮食正常，反应敏捷，被毛有光泽，体态充盈。其余2组在口服BAS缓冲液期间饮食、外观都与正常组大鼠无差别。尾静脉注射BAS后，2组大鼠出现倦怠，嗜睡，食欲减退等症状，3d后上述症状好转。尾静脉注射SEB后，模型组大鼠精神萎靡，少动抱团，1周以后症状改善。

2.2 各组大鼠24h尿蛋白定量比较：造模第6周末，除正常组外，其余2组大鼠24h尿蛋白定量明显升高，与正常组相比均有统计学意义(P<0.05)，但2组之间差异无统计学意义。造模第8周末，除正常组外2组大鼠24h尿蛋白较第6周末升高(P<0.05)，但2组之间差异仍无统计学意义。造模12周末，肾炎宁组大鼠的24h尿蛋白定量较模型组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。造模第16周末，肾炎宁组大鼠的24h尿蛋白定量较模型组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，且与8周、12周尿蛋白量比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。3组在组间、时点间以及组间与时点间交互作用差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1。

组别24h尿蛋白造模前造模6周末造模8周末造模12周末造模16周末正常组2．45±1．272．56±1．322．87±1．212．57±1．153．36±0．78模型组2．76±1．4612．78±2．9619．13±1．4721．72±1．4920．96±0．62肾炎宁组2．68±1．3913．11±2．0919．84±2．2817．85±2．2416．88±0．87组间F=1419．850 P<0．01时点间F=258．141 P<0．01组间·时点间F=64．162 P<0．01

2.3 病理检查结果：光镜下，正常组肾小球结构完整，肾小球系膜、基质未见明显异常改变；模型组可见肾小球系膜细胞增生、系膜基质增多、系膜区增宽、部分肾小管发生空泡变性；肾炎宁组也有不同程度病理改变，但与模型组相比病变减轻。见图1。

2.4 免疫荧光观察：正常组肾小球系膜区无免疫复合物沉积，模型组可见免疫复合物沿肾小球系膜呈颗粒状分布，肾炎宁组也有不同程度的免疫复合物沉积，但较模型组减轻。见图2。

3 讨 论

IgA肾病是最常见的肾小球疾病，本病临床上表现为发作性或持续性肉眼血尿、镜下血尿和(或)蛋白尿、高血压、肾病综合征及肾功能受损，部分病情严重者进展为终末期肾病,其特征是肾活检免疫病理显示在肾小球系膜区以IgA为主的免疫复合物沉积，以肾小球系膜增生为基本组织学改变[1]。祖国医学对血尿的研究历史较为悠久，在中医历史文献中的记载属“尿血”、“溲血”范畴[2]。本病初期由于六淫外邪、湿毒或湿热等毒邪炽盛伤肾，病情缠绵难愈，病程较长，久病致虚，久病必瘀[3]。历代医家在其著作里都曾对本病的发病原因进行阐述。《素问·气厥论》谓:“胞移热于膀胱,则癃溺血”，提出了本病的病因为膀胱有热；《金匮要略》指出:“热在下焦者则尿血”，首次提出了“尿血”的病名；《痿论》又云:“悲哀太甚则胞络绝,胞络绝则阴气内动,发则心下崩,数溲血也”。《诸病源候论》认为:“劳损于肾,动伤经络,又为风冷所侵,血气击搏,故腰痛也”。血尿多与热有关，血尿的病机与热、虚、瘀、外感风热之邪侵袭人体有关；思虑劳倦过度，损伤脾胃，致使气血失和，湿热内聚，热伤血络，热迫血妄行，则发病；肾阴亏虚，阴虚内热，灼伤血络而致尿血，而出血多伴有瘀滞，瘀血阻络，血不循经，则血尿不止；此外，邪热下扰肾络，则往往使血尿加重或反复。总之，IgA肾病形成机制是非常复杂的。既有脾肾脏腑功能失调至气阴两虚，又有湿浊瘀血作祟。

根据IgA肾病“本虚标实，虚实夹杂”的发病机制而拟肾炎宁方，由黄芪、生地黄、党参、茯苓、白术、白茅根、女贞子、墨旱莲、川芎、三七粉、仙鹤草、甘草等药物组成。方中黄芪既可补益宗气，又可行气活血，生地黄既可养阴生津，又可凉血止血，两者共为君药，共奏益气养阴之效；党参补气生津，白术益气利水，两者相互配合可助君药加强补气之效；女贞子、墨旱莲取二至丸之效，助君药滋阴之功；茯苓既可益气，又可利水消肿；白茅根清热祛湿；三七粉、仙鹤草凉血止血；川芎活血行气。诸药配合标本兼治，确能切中病机。现代药理研究认为，黄芪主要成分为黄芪皂甙、黄芪多糖等，具有强心、利尿、提高机体免疫力、抗氧化、改善血流状态等作用[4]；茯苓的主要化学成分为茯苓糖、茯苓素及麦角甾醇等，能调节免疫、抗肿瘤、抗炎[5]。女贞子、墨旱莲具有调节免疫机能、改善血液流变性、抗炎等作用[6]。川芎的有效成分主要有挥发油、生物碱、有机酸等，它能抗氧化、抗过敏、改善血流状态、增加微循环、提高机体免疫力。白茅根的有效成分包括三萜类、黄酮、内酯类、糖类等，有利尿、抗炎、止血、抗菌及免疫调节等作用。三七主要成分为三七总皂苷，还含有黄酮、三七素、挥发油成分，具有抗凝、抗纤维化、抗炎、抗衰老、调节血管收缩、降压等功能。

本实验结果显示，肾炎宁能改善IgA肾病大鼠的一般情况，减少24h尿蛋白定量，改善肾脏病理变化，延缓IgA肾病的进程，进而缓解肾脏损伤的程度。(本文图见封三)

[1] 龚豪,梁伟,丁国华,等.原发性IgA肾病与非IgA系膜增生性肾小球肾炎的临床病理分析[J].临床肾脏病杂志,2012,12(1)：12-14.

[2] 赵文玉.辨证论治IgA肾病93例[J].陕西中医,2013,34(9): 1158-1160.

[3] 白会玲,陈丽辉.通络祛湿法治疗70例IgA肾病临床观察[J].临床荟萃,2012,27(17)：1540-1542.

[4] 仝欣.黄芪主要活性成分的药理作用[J].时珍国医国药,2011,22(5)：1246-1249.

[5] 王海峰.茯苓的现代研究进展[J].社区医学杂志,2011,9(12): 44-45.

[6] 蔡秀江，黄美艳，丁安伟，等.二至丸考源及药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2011,17(23):272-275.

(本文编辑：许卓文)

2014-06-19；

2014-07-09

梁建英(1971-)，女，河北石家庄人，河北省石家庄市第一医院副主任医师，医学硕士，从事老年疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail：dabc1234@qq.com

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1007-3205(2014)08-0927-03