非结核分枝杆菌2种培养方法和药物敏感性试验研究

王艳彬，吴海峰(.河北省血液中心检验科，河北 石家庄 05006；2.河北省胸科医院检验科，河北 石家庄 05004)

·论著·

非结核分枝杆菌2种培养方法和药物敏感性试验研究

王艳彬1，吴海峰2*
(1.河北省血液中心检验科，河北 石家庄 050061；2.河北省胸科医院检验科，河北 石家庄 050041)

目的探讨BACTEC MGIT 960液体培养法和CLSI M24-A微量肉汤稀释法快速药敏试验对非结核分枝杆菌的意义。方法分别采用BACTEC MGIT 960液体培养法联合微量肉汤稀释法的快速药敏试验与L-J固体培养法和绝对浓度药敏法对48株非结核分枝杆菌进行培养，并对2种方法的培养时间和药敏报告时间进行比较。结果48株非结核分枝杆菌在BACTEC MGIT 960培养仪的平均阳性报告时间(7.0±5.3)d，L-J培养基平均阳性报告时间(17.5±10.2)d，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。微量肉汤稀释法结果阳性报告时间为7～14d，L-J固体药敏试验阳性报告时间为28d，2种药敏试验方法对相同种类药物的耐药率分析结果差异无统计学意义(P>0.05)，微量肉汤稀释法比L-J法可以检测的药物种类更多。结论BACTEC MGIT 960液体培养法联合微量肉汤稀释法快速药敏试验比L-J固体培养法和绝对浓度药敏法在培养时间、药敏结果种类和报告时间上优势明显。

非结核分枝杆菌；微生物敏感性试验；细菌学技术

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.07.020

分枝杆菌属除了结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌外统称为非结核分枝杆菌(nontuberculousmycobacteria，NTM)，NTM在自然界中广泛存在，属于条件致病菌，目前已发现约160多种。NTM病具有与结核病临床表现相似的全身中毒症状和局部组织损害，与结核病难以区分，但其治疗却与结核病有不同之处。2000年中华医学会结核病学分会制定出《非结核分枝杆菌病诊断与处理指南》，2007年美国胸科协会(AmericanThoracicSociety,ATS)和美国传染病学会(InfectiousDiseasesSocietyofAmerica,IDSA)也提出了NTM肺病的临床和微生物学诊断标准，2种诊断标准大致相同，均提出NTM肺病的诊断主要依靠病原微生物学[1-2]。NTM菌种筛查和药敏结果在流行病学上和临床诊断、治疗上都有重要意义[3]。本实验采用BACTECMGIT960液体培养法联合CLSIM24-A微量肉汤稀释法的快速药敏试验与经典的L-J固体培养法和绝对浓度药敏法作比较，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选择2012年1—12月在河北省胸科医院就诊的患者，采集痰、支气管镜灌洗液、脓标本进行分枝杆菌培养，剔除重复送检患者，共分离出48株NTM。

1.2 标准菌株：结核分枝杆菌H37Rv、牛分枝杆菌购自生物制品研究所。

1.3 仪器、试剂：BACTECMGIT960培养仪，BBLpreparedculturemedia培养管均购自美国BD公司；快速药敏试验用肉汤购于上海积彩医疗器械有限公司公司;改良L-J培养基及药敏培养基按《结核病诊断细菌学检验规程》[4]自制。

1.4 方法：快速药敏试验根据CLSIM24-A微量肉汤稀释法，每种药物选择高低2个浓度，将药物包被在96孔U型微量反应板上。浓度分别为链霉素(streptomyci，SM)2、8mg/L,异烟肼(isoniazid，INH)0.4、1.6mg/L，利福平(rifampicin，RFP)2、8mg/L，乙胺丁醇(ethambutol，EMB)4、16mg/L，氧氟沙星(ofloxacinforinjection，OFX)2、8mg/L，左氧氟沙星(levofloxacin，LVFX)2、8mg/L，阿米卡星(amikacin，AK)1、4mg/L，卷曲霉素(capreomycin,CM)2.5、10μg/mL，丙硫异烟胺(protionamide，1314Th)10、40mg/L，力克肺疾(isoniazidaminosalicylate，Dpc)0.5、2mg/L，莫西沙星(moxifloxacin，Mfx)0.5、2mg/L，环丙沙星(ciprofloxacin，CPI)1、4mg/L，克拉霉素(clarithromycin，Clr)4、16mg/L，利福布丁(rifabutin,RFB)0.75、3mg/L，利奈唑胺(linezolid，Lz)2、8mg/L，加替沙星(gatifloxacin，Gfx)2、8mg/L。

L-J药敏培养基按《结核病诊断细菌学检验规程》[4]每种药物高低2个浓度。分别为SM10、100mg/L，INH1、10mg/L，RFP50、250mg/L，EMB5、50mg/L，Dpc1、10mg/L，LVFX2、20mg/L

1.5 菌型判定：用于菌型鉴定的C2-羧酸肼噻吩(TCH)100mg/L，对硝基苯甲酸(PNB)500mg/L。PNB-、TCH+为人型结核菌；PNB-、TCH-为牛型结核菌；PNB+、TCH+为NTM。

2 结 果

2.1 2种方法NTM阳性报告时间：48株NTM在BACTECMGIT960培养仪的阳性报告时间2～20d，平均(7.0±5.3)d；L-J培养基阳性报告时间7～52d，平均(17.5±10.2)d。2组差异有统计学意义(t=6.329，P<0.01)。

2.2NTM药敏结果分析:在报告阳性后涂片抗酸染色确定为抗酸菌阳性，将培养物分别接种微量反应板和L-J药敏培养基，7～14d后观察微量反应板各孔的生长情况，进行菌型分型和获得药物MIC值。L-J常规药敏试验28d后根据生长状况得到药敏实验结果。SM、INH、RFP、EMB、LVFX、Dpc这6种常用的抗结核药物耐药率均在90%以上，与L-J法检出的耐药率相差无几，见表1。

微量肉汤稀释法的快速药敏试验还可以对OFLX、AK、CM、1314Th、Mfx、CPI、Clr、RFB、Lz、Gfx10种药物进行药敏试验 ，比L-J常规药敏试验所做的药物种类多，药物选择的范围大，临床用药指导意义更大。

表1 NTM 2种药敏试验结果Table 1 Two kinds of susceptibility testing for nontuberculous mycobacteria (n=48，n，%)

Sm:streptomyci； Inh：sonicotinic acid hydrazide；Rfp：rifampicin;Emb:ethambutol; Lfx :levofloxacin;Dpc:isoniazid aminosalicylate

3 讨 论

NTM广泛存在于自然界,大部分是腐物寄生菌，主要见于水、土壤和气溶胶。NTM的疏水特性形成的生物膜使其可持续生存于供水系统中。人可从环境中感染NTM而患病，水和土壤是重要的传播途径。与结核分枝杆菌比较，NTM毒力和致病性均较低，通常属于机会性致病菌。NTM的易感者主要是慢性呼吸道疾病(慢性阻塞性肺疾病、肺结核残余空洞、矽肺、支气管扩张症、肺囊性纤维化等)和免疫抑制者特别是获得性免疫缺陷病患者，在获得性免疫缺陷病和免疫受损宿主中，NTM通常表现为播散性。NTM病肺病的临床特点因为与结核极其相似而极易发生误诊或漏诊，因而对于反复慢性咳嗽咳痰，尤其是有支气管扩张等慢性呼吸道疾病的患者，肺部出现上述病灶特点，应警惕NTM病感染的可能[2]。

近年来NTM所致疾病报道的增多，越来越引起临床对分枝杆菌培养和NTM分离鉴定的重视。由于NTM对常用抗结核药物普遍耐药，传统菌种鉴定方法根据菌株生长速度、色素产生、光反应、生化反应等进行分群，繁琐费时，不利于指导临床诊断[5]。因此，快速的菌型分型和药敏试验结果对NTM病的确诊和治疗方案的调整显得尤为重要。

L-J培养和药敏试验法，NTM培养平均阳性报告时间为(17.5±10.2)d，最快阳性报告时间7d，最慢为52d，抗酸染色确定阳性后接种药敏培养基大约需要4～8周才能得到药敏结果。已经不能满足临床需求。因此，迫切需要一种简单快速的培养、菌种初筛和药敏试验的方法，以帮助临床制定合理有效的用药方案。

利用BACTEC MGIT 960液体培养基进行分枝杆菌培养，非结核分枝杆菌平均阳性报告时间为(7.0±5.3)d，最快阳性报告时间为2d，最慢为20d。NTM在960培养管中不形成典型的条索状生长，通过抗酸染色确定为抗酸菌阳性后，根据CLSI M24-A微量肉汤稀释法原理，接种包被好的96孔U型微量反应板上，培养7～14d后即可得到菌种鉴定和药敏试验结果。

药敏试验药物组合包括了常用的一线和二线抗结核药物。有研究[6]显示药敏试验结果统计NTM对常用的药物SM、INH、RFP 3种药物100%耐药。另有研究[7]显示NTM对EMB耐药率90%以上，对Dpc、Ofx、Lfx、Pto、RFP耐药率也达到90%以上，对Cip、Gfx、Mfx耐药率达到70%以上。本研究48株NTM耐药率非常高，可能与就诊的患者大都经过其他医院的治疗或者有不规范的化疗经历有关。

目前国内对NTM的分型的检验技术尚未普及，核酸探针、PCR技术、基因芯片和细胞壁脂肪酸色谱分析等新技术尚未成熟用于临床诊断，传统的固体培养药敏方法需要时间长，我们利用现有BACTEC MGIT 960液体快速培养法，结合CLSI M24-A微量肉汤稀释法可以使NTM的菌型初筛和药敏结果时间缩短到15～30d，有利于临床根据菌种初筛及药物敏感试验结果，及时更改治疗方案，减轻患者的痛苦和经济负担。

由于本研究样本资料均来源于同一医院，且样本量不够大，只能菌种初筛而不能准确分型，故研究结论尚需要大规模的实验进行证实和完善。

[1] Chinese MedicaI Association of tuberculosis．Guidline on diagnosis and treatment of non tuberculous myeobacterial diseases[J].Chin J Tuberculosis Respir Dis，2000，23：650-653.

[2] GRIFFITH DE，AKSAMIT T，BROWN-ELLIOTT BA，et al.An official ATS/IDSA statement：diagnosis，teeatment，and prevention of nontuberculous mycobaeterial diseases[J].Am J Respir Crit Care Med，2007，175(4)：367-416.

[3] 吴龙章，李一耕，蔡杏珊，等.同时从痰液、胸腔积液分离出鸟分枝杆菌1例[J].中华结核和呼吸杂志，2000，23(10)：601.

[4] 中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程[J].中国防痨杂志，1996，18(1)：28-31.

[5] 梁建琴，吴雪琼，张俊仙，等.应用聚合酶链反应-膜芯片技术快速鉴定分枝杆菌菌种[J].河北医科大学学报，2004,25(5)：289-291.

[6] FUJITA Y,LSHII S,HIRANO S,et al.A case of lung cancer complicatedwith active non-tuberculous mycobacterium(NTM) infection successfully treated with anti-cancer agents and anti-NTM agents[J].Nihon Kokyuki Gakkai Zasshi,2011,49(11)：855-860.

[7] 史祥，尹洪云.58例非结核分枝杆菌肺病住院患者的临床分析[J].临床肺科杂志，2013,18(2)：311-312.

(本文编辑：刘斯静)

TWOSETSOFNON-TUBERCULOUSMYCOBACTERIUMCULTUREMETHODANDDRUGSENSITIVITYTESTSTUDY

WANGYanbin1，WUHaifeng2*
(1.ClinicalLaboratory，BloodCenterofHebeiProvince,Shijiazhuang050061,China2.ClinicalLaboratory，ChestHospitalofHebeiProvince,Shijiazhuang050041,China)

CT:ObjectiveTostudytheBACTECMGIT960liquidculturemethodandtheCLSIM24-Abrothmicrodilutionmethodforrapidsusceptibilitytestingthesignificanceofnon-tuberculousmycobacteria.MethodsTheBACTECMGIT960liquidculturebrothmicrodilutionmethodcombinedrapidsusceptibilitytesting,andL-Jsolidculturemethodcombinedtheabsoluteconcentrationsusceptibilitymethodwererespectivelyusedin48strainswithnontuberculousmycobacteri,theculturetimeandsensitivityreportingperiodoftwocombinationmethodswerecompared.ResultsTheaveragepositivereporttimein48strainsofnontuberculousmycobacteriaculturewithBACTECMGIT960instrumentwas(7.0±5.3)d,whilethatofL-Jmediawas(17.5±10.2)d,incomparisontheresultsoftwomethodsweresignificantlydifferent(P<0.05),thereportedtimeofbrothmicrodilutionFranceresultswas7-14d,thereporttimeofL-Jsolidsusceptibilitytestwas28d,thecomparisonshowedsignificantdifference,twokindsofsusceptibilitytestingmethodsforthesametypeofdrugresistancerateanalysisshowednosignificantdifference(P>0.05),brothmicrodilutionmethodcandetectmoretypesofdrugsthantheL-Jmethod.ConclusionBACTECMGIT960liquidculturebrothmicrodilutionmethodcombinedrapidsusceptibilitytestinghasobviousadvantagesoverL-Jsolidculturemethodandtheabsoluteconcentrationsusceptibilitymethodintheincubationtimeandsusceptibilityresultsreportingtimetypes.

nontuberculousmycobacteria；microbialsensitivitytests；bacteriologicaltechniques

2013-10-22；

2013-12-30

河北省医学科学研究重点课题计划(20100208)

王艳彬(1978-)，男，河北藁城人，河北省血液中心主管检验师，医学学士，从事病毒学检验研究。

*通讯作者。E-mail：haifengwu77@163.com

R378.91

A

1007-3205(2014)07-0797-04