丁苯酞对弥漫性脑损伤大鼠脑水肿及皮层基质金属蛋白酶9、咬合蛋白表达的影响

孙东良，王丽娜，刘永亮，王丽娟，王 鹏(.河北省唐山市曹妃甸区医院神经外科，河北 唐山 0600；.河北省唐山市人民医院神经外科，河北 唐山 06000；.河北省唐山市丰润区第二人民医院检验科，河北 唐山 06000)

·论著·

丁苯酞对弥漫性脑损伤大鼠脑水肿及皮层基质金属蛋白酶9、咬合蛋白表达的影响

孙东良1，王丽娜2，刘永亮2，王丽娟3，王 鹏2
(1.河北省唐山市曹妃甸区医院神经外科，河北 唐山 063200；2.河北省唐山市人民医院神经外科，河北 唐山 063000；3.河北省唐山市丰润区第二人民医院检验科，河北 唐山 063000)

目的探索丁苯酞对弥漫性脑损伤大鼠模型脑水肿及皮层基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、咬合蛋白表达的影响。方法Sprague-Dawley 雄性大鼠140只，随机分为对照组和丁苯酞组(40mg/kg，1次/d)各70只。应用Marmarou法建立弥漫性脑损伤大鼠模型。2组分别于术后6、12、24、72、144h采用干湿质量法检测大鼠脑组织含水量变化，采用免疫组织化学检测损伤区周围皮层MMP-9和咬合蛋白表达变化。2组分别于术后6、24、72、144h采用Western blot法检测损伤区周围皮层MMP-9和咬合蛋白含量变化。结果与对照组比较，丁苯酞组脑组织含水量降低，损伤区周围皮层MMP-9表达减少(P<0.05)，咬合蛋白表达增多(P<0.05)。结论丁苯酞可降低弥漫性脑损伤大鼠皮层MMP-9的表达，增加咬合蛋白的表达，减轻脑水肿的形成。

脑损伤；脑水肿；基质金属蛋白酶9；丁苯酞

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.07.004

丁苯酞是我国自行研制的一类治疗缺血性脑血管病的新药，对急性脑梗死有明显的治疗作用[1]。为弄清丁苯酞的作用机制，本研究观察了丁苯酞对颅脑损伤大鼠脑水肿及损伤区周围皮层基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)、咬合蛋白表达的影响，旨在为丁苯酞在颅脑损伤中的应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 动物分组：健康Sprague-Dawley雄性大鼠140只，清洁级,体质量280～320g，由河北联合大学实验动物中心提供。按照随机数字表法分为对照组和丁苯酞组各70只。分别于6、12、24、72 、144h行脑组织含水量测定和免疫组织化学检测，每个时间点5只，脑组织含水量每组25只，免疫组织化学每组25只。2组再分别于6、24、72、144h行Westernblot检测，每个时间点5只，Westernblot每组20只。

1.2 模型制备和给药方法：参考Marmarou法[2]制作大鼠弥漫性脑损伤模型。乙醚麻醉动物(麻醉时间为70～150s)，将麻醉好的大鼠俯卧位固定于海绵床垫(10cm×20cm×30cm)上，将质量450g、直径18mm的铜棒自1.5m高度垂直落下撞击置于大鼠冠状缝与失状缝正中的不锈钢垫，造成大鼠弥漫性颅脑损伤。丁苯酞组大鼠从致伤后30min起给予丁苯酞软胶囊植物油溶液，药物剂量按40mg/kg灌胃，1次/d，直至各时间点处死。对照组给予等量植物油。

1.3 脑组织含水量测定：随机选取2组各时间点大鼠各5只，以10%水合氯醛麻醉，断头处死，开颅取脑，从损伤区周围取200mg脑组织，应用MA110电子分析天平(上海第二天平仪器厂)称湿质量并记录后置于105℃恒温干燥箱内干燥48h至恒质量，分析比较2组大鼠脑组织含水量变化。脑含水量称干质量后按Elliot公式计算，脑含水量=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。

1.4 免疫组织化学染色：随机选取2组各时间点大鼠各5只，深度麻醉后开胸,4%多聚甲醛灌注,断头取脑,置于4%多聚甲醛液中4℃冰箱过夜至组织块沉底。冠状切取2mm厚包含损伤区域及左右半球的组织块浸于4%多聚甲醛中再固定4h。经常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。将石蜡包埋的组织块取出放入切片机中做连续切片,片厚5μm。取各大鼠等部位切片3张，经二甲苯二级脱蜡各5min，梯度酒精脱水，3%双氧水室温10min，以消除内源性过氧化物酶，高压热修复，后分别滴加1∶100比例稀释的抗MMP-9一抗和1∶200比例稀释的抗咬合蛋白一抗，4℃过夜，次晨取出置常温，磷酸盐缓冲液冲洗后，滴加二抗，37℃孵育1h，二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色，水冲洗后苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封片。光镜下观察细胞核呈蓝色，阳性细胞肿胀，包浆黄染。在200倍显微镜下在伤灶周围随机选取5个视野，用美国MediaCybernetics公司生产的Image-Pro-Plus图像分析系统照相后计算每个视野中阳性细胞数目。

1.5Westernblot法：用细胞裂解液提取2组各时间点大鼠损伤区周围脑组织总蛋白，运用考马·斯亮蓝比色法测定各个样本蛋白含量，上样量为100μg蛋白。进行15%SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭；山羊抗MMP-9多克隆一抗(1∶500稀释)，山羊抗咬合蛋白多克隆一抗(1∶500稀释)，山羊抗actin多克隆一抗(1∶1 000稀释)，4℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶1 000稀释)进行杂交。EcL发光剂3min，曝光，显影，定影。采用数码成像分析系统软件对Westemblot结果进行定量分析。

2 结 果

2.1 脑组织含水量：对照组和丁苯酞组脑损伤后脑组织中含水量逐渐增加，24h达到高峰，72h缓慢下降，144h基本达到6h水平(P<0.05)。与对照组相比，丁苯酞组大鼠脑组织含水量降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

GroupsCorticalwatercontent(%)6h12h24h72h144hFPControl74．16±0．23 75．55±0．24∗79．30±0．27∗#78．05±0．25∗#△73．10±0．18#△☆33．8320．000Butylphthalide73．63±0．26∗74．78±0．25∗77．54±0．27∗#76．23±0．26∗#△72．38±0．25#△☆317．1880．000 t3．4034．91910．46711．4285．254 P0．0090．0010．0000．0000．001

*P<0.05vs6h #P<0.05vs12h △P<0.05vs24h ☆P<0.05vs72h byqtest

2.2 MMP-9免疫组织化学结果：脑损伤后对照组和丁苯酞组MMP-9阳性细胞(被染成棕黄色)数均随时间延长逐渐增加，24h达到高峰，72h开始减少，144h基本达到6h水平(P<0.05)。丁苯酞组每个时点MMP-9阳性细胞数均较对照组明显减少(P<0.05或<0.01)。见表2。

GroupsMMP⁃9(cells/HP)6h12h24h72h144hFPControl28．60±2．7055．40±3．21∗111．80±2．95∗#75．80±2．86∗#△27．40±3．21#△☆697．9020．000Butylphthalide23．00±2．9241．80±2．59∗86．20±1．92∗#48．00±4．58∗#△22．00±2．55#△☆367．2520．000 t3．1507．37616．25611．5042．946 P0．0140．0000．0000．0000．019

*P<0.05vs6h #P<0.05vs12h △P<0.05vs24h ☆P<0.05vs72h byqtest

2.3 咬合蛋白免疫组织化学结果:脑损伤后对照组和丁苯酞组咬合蛋白阳性细胞(被染成棕黄色)数随时间延长逐渐减少，24h减到最低，72h开始增加，144h基本达到6h水平(P<0.05)。丁苯酞组每个时点咬合蛋白阳性细胞数均较对照组明显增多(P<0.05或<0.01)。见表3。

GroupsOccludin(cells/HP)6h12h24h72h144hFPControl29．80±0．4517．20±2．59∗10．00±2．65∗#15．60±1．14∗△30．80±2．95#△☆88．2760．000Butylphthalide32．40±1．5226．40±1．14∗18．60±1．82∗#25．60±0．55∗△33．60±0．89#△☆113．3500．000 t3．6777．2735．99217．6782．031 P0．0160．0010．0000．0000．047

*P<0.05vs6h #P<0.05vs12h △P<0.05vs24h ☆P<0.05vs72h byqtest

2.4 MMP-9 Western bolt结果: 脑损伤后对照组和丁苯酞组MMP-9蛋白表达均随时间延长逐渐增加，24h达到高峰，72h后开始减少(P<0.05)。丁苯酞组每个时点MMP-9蛋白表达均较对照组明显减少(P<0.01)。见表4、图1。

GroupsMMP⁃9(%)6h12h24h72h144hFPControl28．97±1．08 77．52±0．60∗65．37±0．47∗#34．59±0．54∗#△5423．7010．000Butylphthalide24．36±0．8654．53±0．68∗39．23±0．80∗#26．85±1．29∗#△1093．4800．000t7．46256．75363．16312．386P0．0000．0000．0000．000

*P<0.05vs6h #P<0.05vs24h △P<0.05vs72h byqtest

2.5 咬合蛋白Western bolt结果:脑损伤后对照组和丁苯酞组咬合蛋白表达随时间延长逐渐减少，24h减到最低，72h开始增加，144h达到最高水平(P<0.05)。丁苯酞组每个时点咬合蛋白表达均较对照组明显增多(P<0.01)。见表5、图1。

GroupsOccludin(%)6h24h72h144hFPControl186．87±0．71146．26±0．81∗164．50±0．61∗#197．03±0．61∗#△5458．9310．000Butylphthalide204．41±0．82168．54±0．81∗190．76±0．50∗#211．30±1．12∗#△2518．0880．000 t36．04643．71274．60325．080 P0．0000．0000．0000．000

*P<0.05vs6h #P<0.05vs24h △P<0.05vs72h byqtest

图1 Western bolt检测损伤区周围皮层MMP-9和咬合蛋白表达

1.对照组6h；2.对照组24h；3.对照组72h；4.对照组144h；.5.丁苯酞组6h；6.丁苯酞组24h；7.丁苯酞组72h；8.丁苯酞组144h

Figure 1 MMP-9 and occludin Western blot results

1.Control group 6h；2.Control group 24h；3.Control group 72h；4.Control group 144h；5.Butylphthalide group 6h；6.Butylphthalide group 24h；7.Butylphthalide group 72h；8.Butylphthalide group 144h

3 讨 论

丁苯酞是一类治疗急性缺血性脑血管病的新药。既往研究[3-5]表明，丁苯酞具有改善脑微循环，增加脑血流量，抑制炎症反应，保护线粒体，改善脑组织能量代谢，减轻自由基损伤，抑制氧化应激，保护血脑屏障，抑制神经细胞凋亡等作用。提示丁苯酞可减轻脑水肿的形成。而颅脑损伤后脑水肿的形成，是引起脑损伤后继发死亡的主要原因。本研究结果示，脑损伤后6h脑水肿即开始形成，24h达高峰，72h开始缓解，144h脑水肿明显缓解；而丁苯酞组脑组织含水量较对照组明显减少。提示丁苯酞对脑损伤后脑水肿有明显的治疗作用。

MMP是一种锌离子依赖性蛋白酶，主要参与调解细胞外的基质成分，临床上主要参与动脉粥样硬化、肿瘤转移、炎症反应等病理过程[6]。其中MMP-9主要存在于脑组织中，与脑血管病的关系最为密切。MMP-9可通过攻击脑血管外基膜的主要成分层黏蛋白和纤黏蛋白，破坏血脑屏障，导致血脑屏障通透性增高，从而加重脑水肿的形成。而本研究表明脑损伤发生后MMP-9表达明显增加，丁苯酞组MMP-9表达明显减少。提示丁苯酞可减少MMP-9的表达。Gidday等[7]发现白细胞，特别是中性粒细胞是脑组织中MMP-9的主要来源，而MMP-9能促进白细胞的募集，造成继微血管基底膜层黏蛋白水解后血脑屏障通透性的破坏，最终导致神经元的损伤。当颅脑损伤发生后继发炎性反应，导致中性粒细胞数目增多，MMP-9生成增多。而丁苯酞具有抑制炎症反应的作用。炎性细胞因子和C反应蛋白参与急性脑梗死的病理过程[8]。朱海生等[9]研究表明，丁苯酞具有抑制慢性脑供血不足患者血清C反应蛋白表达的作用。推测丁苯酞可能是通过抑制炎症反应来减少MMP-9表达的。

咬合蛋白是血管内皮紧密连接的主要组成部分。郭平等[10]认为咬合蛋白的磷酸化状态与紧密连接功能的维持密切相关。当咬合蛋白破坏时，紧密连接屏障功能受损，血脑屏障通透性增高，脑水肿形成。本研究结果表明，脑损伤发生后，损伤区周围皮层咬合蛋白含量明显下降，而丁苯酞可提高咬合蛋白的表达。MMP-9的表达与咬合蛋白的表达趋势正好相反，我们认为颅脑损伤后通过炎症反应激活了MMP-9，进而降解了血管内皮紧密连接中的咬合蛋白，从而导致了脑水肿的形成。而丁苯酞具有抑制炎症反应的作用，可减少MMP-9的激活，从而减少咬合蛋白的破坏。此外，Seth等[11]研究发现，细胞内钙离子浓度的升高，也可导致咬合蛋白发生磷酸化。脑损伤发生后引起的应激反应及缺血缺氧均可引起细胞内钙离子浓度升高，从而使咬合蛋白磷酸化，紧密连接屏障功能受损。而鄢学芬等[12]研究表明，丁苯酞可降低神经细胞内钙离子浓度的升高。我们认为丁苯酞可能通过改善脑微循环，保护线粒体，改善缺血区的能力代谢，降低细胞内的钙离子浓度，从而减轻咬合蛋白的磷酸化。

综上所述，丁苯酞可减轻弥漫性脑损伤大鼠脑水肿的形成，对脑损伤有一定的治疗作用。丁苯酞可能是通过减少梗死灶周围MMP-9的表达，减轻MMP-9对脑血管紧密连接中咬合蛋白降解，减轻血脑屏障的破坏，从而减轻脑水肿的形成。

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[10] 郭平,周其全.咬合蛋白在血脑屏障通透性改变中的作用[J].国际脑血管病杂志,2010,18(6):466-472.

[11] SETH A,SHETH P,ELIAS BC,et al.Protein phosphatases 2A and 1 interact with occludin and negatively regulate the assembly of tight junctions in the CACO-2 cell monolayer[J].J Biol Chem,2007,282:11487-11498.

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(本文编辑：许卓文)

EFFECTOFBUTYLPHTHALIDEONBRAINEDEMAOFRATSAFTERFOCALCEREBRALINFARCTIONANDEXPRESSIONOFCORTICALMATRIXMETALLOPROTEINASE-9ANDOCCLUDIN

SUNDongliang1,WANGLina2,LIUYongliang2,WANGLijuan3,WANGPeng2
(1.DepartmentofNeurosurgery,CaofeidianHospitalofTangshanCity,HebeiProvince,Tangshan063000,China;>2.DepartmentofNeurosurgery,thePeople′sHospitalofTangshanCity,HebeiProvince,Tangshan063000,China;3.DepartmentofLaboratory,FengrunSecondPeople′sHospitalofTangshanCity,HebeiProvince,Tangshan063000,China)

CT:ObjectiveToexploretheeffectofbutylphthalideonthebrainedemaofratsfollowingtraumaticbraininjuryandtheexpressionofcorticalmatrixmetalloproteinase-9(MMP-9)andoccludinaroundtheinjuryarea.MethodsOnehundredandfortySprague-Dawleymaleratsweredividedintocontrolgroupandbutylphthalidegroup(40mg/kg，onceaday).ThemodelwasmadebyMarmaroumethod.Afterinjury6h,12h,24h,72hand144h,brainwatercontentwasmeasuredtoobservethechangesofthebrainedema,theimmunohistochemistryandWesternblotwereusedtoobservetheexpressionofMMP-9andoccludinaroundtheinjuryarea.ResultsComparedwiththecontrolgroup,thebrainwatercontentofthebutylphthalidegroupwasless,thecontentofMMP-9aroundtheinjuryareadecreasedsignificantly(P<0.05).Andthecontentofoccludinaroundtheinjuryareaincreased(P<0.05).ConclusionButylphthalidecouldreducetheexpressionofMMP-9followingtraumaticbraininjury,increasetheexpressionofMMP-9,andreducethebrainedema.

braininjuries;brainedema;matrixmetalloproteinase9;butylphthalide

2013-11-18；

2014-02-14

河北省卫生厅科研基金项目(20130384)

孙东良(1972-)，男，河北唐山人，河北省唐山市曹妃甸区医院主治医师，医学学士，从事神经外科疾病诊治研究。

R651.15

A

1007-3205(2014)07-0756-05