无患子药材及总皂苷HPLC指纹图谱
2014-09-04
(西华大学生物工程学院，四川 成都 610039 )
无患子属于无患子科无患子属，主产于东南亚各国，我国的长江流域、南部各省及海南岛等地区[1]。无患子的主要化学成分为无患子皂苷(sapindus saponin)、脂肪油、蛋白质等[2]。无患子皂苷主要是三萜类皂苷和倍半萜类糖苷，常春藤皂苷元是无患子皂苷元的最主要皂苷元。无患子有很多种生物活性，在抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、抗真菌、抗炎、杀精、保肝等方面均有作用[2-5]。无患子果皮提取物的表面活性较强，有较强的杀菌作用[6]，同时无患子还是一种新型的去皮肤金属沾染洗涤剂[7]。这种洗涤剂对皮肤刺激小，对机体基本无害，对各种重金属对皮肤沾染洗脱率在90%以上[2，8]。本文采用高效液相色谱梯度洗脱法，对无患子药材、无患子总皂苷进行了指纹图谱的研究，可为无患子药材、无患子总皂苷的质量控制提供依据。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2487双波长紫外检测器(美国Waters公司)；JJ1004小型超声波清洗器(东莞市嘉劲机械有限公司)；旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；HH-S数显恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂)。
1.2试剂
无患子药材产地如表1所示；无患子总皂苷10批(根据大孔吸附树脂的分离纯化工艺制得)；常春藤皂苷元(批号111733-201205)对照品(中国生物制品检定所提供)；乙腈为色谱纯(JT-baker)。
表1 无患子药材产地
2 试验方法
2.1 色谱条件
色谱柱：Cromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈-水二元梯度洗脱，检测波长为210 nm，流速1.0 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为20 μL；记录时间为70 min。梯度洗脱程序如表2所示。
表2 梯度洗脱程序
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取常春藤皂苷元对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.503 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。
2.2.2 无患子药材溶液制备
取干燥洁净的无患子果皮粉碎，过80目筛，精密称取药材粉末2.008 g，加甲醇50 mL，超声提取30 min[9]，过滤，用适量的甲醇洗涤残渣和容器，合并滤液与洗液，减压回收溶剂至10 mL，加盐酸2 mL，加热回流水解5 h，放冷，放冷后用三氯甲烷萃取3次，每次用量20 mL，合并三氯甲烷层，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，并转移至10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得[10]。
2.2.3 无患子总皂苷溶液制备
精密称取无患子总皂苷适量，加甲醇10 mL，盐酸2 mL，加热回流水解5 h，放冷后用三氯甲烷萃取3次，每次用量20 mL，合并三氯甲烷层，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，并定容至10 mL容量瓶中，摇匀，即得[10]。
2.3 方法学考察
2.3.1 稳定性试验
按2.2项下供试品溶液制备方法制得供试液，分别于0、4、8、16、24 h精密吸取供试品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，于210 nm下测定，测得常春藤皂苷元峰面积值并计算RSD值。结果表明，常春藤皂苷元峰面积的RSD值分别为1.06%和0.62%，供试品溶液(无患子药材溶液和无患子总皂苷)均在24 h内稳定。
2.3.2 重复性试验
取同一批样品5份，按2.2项下供试品溶液制备方法制得5份供试品溶液，吸取供试品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，于210 nm下测定，测得常春藤皂苷元峰面积值并计算RSD值。结果表明，常春藤皂苷元峰面积的RSD值分别为1.18%和1.47%，均小于2%，说明2种样品重现性好，该方法稳定可靠。
2.4 指纹图谱的测定
分别精密吸取上述2种供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录70 min。溶剂空白如图1所示。
图1 溶剂空白
如图1所示，除了在2 min处出现溶剂峰和40～44 min之间有3个由于梯度变化造成的峰外，流动相中没有其他峰干扰样品的分析检测。常春藤皂苷元对照品如图2所示。
图2 常春藤皂苷元对照品
2.5 无患子药材指纹图谱及相似度分析结果
将采集的10批无患子药材按照供试品溶液制备方法，制成S01—10号供试品溶液，按照拟定的色谱条件进行测定，采集各批无患子药材的HPLC图谱。将HPLC图谱处理后导入由国家药典委员会颁布的“中药指纹图谱相似度评价系统2004版A”软件进行相似度分析，图中峰顶端有点标记的为共有峰。指纹图谱匹配图见图3，相似度分析结果见表3。
图3 10批无患子药材HPLC指纹图谱匹配图
由图3及表3可知，10批无患子药材的色谱峰之间无明显差异，除了第3批药材外，其他9批药材相似度均在0.9以上，说明不同产地之间的无患子药材无明显差异，稳定性好，建立的指纹图谱方法可行。
2.6 无患子总皂苷指纹图谱及相似度分析结果
将按工艺制得的无患子总皂苷按照无患子总皂苷供试品溶液制备方法，制成供试品溶液，按照拟定的色谱条件进行测定，采集各批无患子总皂苷的HPLC图谱。将HPLC图谱处理后导入由国家药典委员会颁布的“中药指纹图谱相似度评价系统2004版A”软件进行相似度分析。指纹图谱匹配图见图4，相似度分析结果见表4。
图4 10批无患子总皂苷HPLC指纹图谱匹配图
项目S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10对照指纹图谱S110.9840.9900.8370.8370.8360.9990.9980.9840.9990.982S20.98410.9980.8390.8400.8400.9880.9900.9990.9880.982S30.9900.99810.8420.8420.8420.9930.9950.9980.9930.985S40.8370.8390.84210.9990.9990.8380.8400.8390.8380.920S50.8370.8400.8420.99910.9990.8380.8400.8400.8380.920S60.8360.8400.8420.9990.99910.8380.8400.8400.8380.920S70.9990.9880.9930.8380.8380.83810.9990.9880.9990.984S80.9980.9900.9950.8400.8400.8400.99910.9900.9990.985S90.9840.9990.9980.8390.8400.8400.9880.99010.9880.982S100.9990.9880.9930.8380.8380.8380.9990.9990.98810.984对照指纹图谱0.9820.9820.9850.9200.9200.9200.9840.9850.9820.9841
由图4及表4可知，10批无患子总皂苷之间无明显差异，相似度均在0.9以上，说明无患子纯化工艺稳定可靠。
3 结论
本研究是以皂苷元类成分作为高效液相色谱指纹图谱主要分析成分，由于只有常春藤皂苷元标准品，且无患子皂苷中主要的皂苷元也是常春藤皂苷元，故对于其他的皂苷元成分没有作深入研究。
在不同产地采集的无患子药材，主要成分含量差异不是很大，除了第3批(浙江)相似度未达到0.9外，其余9批相似度均达到0.9以上。经大孔吸附树脂分离纯化工艺得到的10批无患子总皂苷相似度较高，均达到0.9以上，说明大孔吸附树脂分离纯化工艺稳定可靠。
[1]豆子.无患子百变用途[J]. 中国保健营养，2011(9):43-45.
[2]余锦城. 天然无患子皂苷提取分离及测试研究[D]. 安徽：合肥工业大学，2007.
[3]Aruluozhi D K,Veeranjaneyulu A,Bodhankar S L,et al. Pharmacological Studies for the Aqueous Extract of Sapindus Trifoliatus on Centra Nervous System: Possible Antimigraine Mechanisms[J].J Ethnopharmacology，2005, 97:491-496.
[4]Ojha P , Maikhuri J P, Gupta G. Effect of Spermicides on Lactobacillus Acidophilus in Vitro-nonoxynol-9 vs Sapindus Saponins[J]. Contraception, 2003,68：135-137.
[5]Tamura Y. 无患子果皮中皂苷的抗皮真菌活性[J]. 国外医学中医药分册,2004,24(5):300-301.
[6] Tamura Y. The Anti-microzyme Efficacy of Sapindus[J]. Natural Medicines, 2001, 55(1):11-16.
[7]Togiya K G, Satoshi F H. Actual and Potential Applications of Saponins in Human and Animal Nutrition :EP,375082[P]. 1994-04-12.
[8]陈作兴. 无患子去皮肤金属毒物沾染洗涤剂通过鉴定并申请专利[J].职业医学，1987,14(2)：4-8.
[9]刘卫国,杨文钰,肖启银. 三叶木通齐墩果酸的超声提取工艺研究[J]. 中药材，2005,28(2) ：140-141.
[10]何宇新，马育彪，李玲,等. 反相高效液相色谱法测定不同产地无患子药材中常春藤皂苷元的含量[J]. 时珍国医国药, 2010, 21(9):2189-2190.
