基于镧离子增敏效应的四环素残留检测方法

贺江　杨恋　杨品红

摘要：依据稀土离子La3+能够增强四环素紫外吸收强度的原理，建立一种四环素残留快速检测方法。水产品中的四环素残留用EDTA-McIlvaine缓冲液提取，提取液用HLB固相萃取小柱净化；甲醇洗脱液氮吹浓缩至干后的残渣用1 mL 混合溶液（VLa3+溶液 ∶VTris-HCl缓冲溶液 ∶V水=1 ∶1 ∶8）溶解，摇匀，于室温下静止反应30 min，最后将样液置于微量比色皿中在390 nm处测定吸光度，并换算出抗生素残留浓度。结果表明，所建立的方法具有较好的灵敏度、准确度和精密度，可在水产养殖地或超市等现场推广应用。

关键词：稀土元素；紫外吸收；四环素；抗生素残留；快速测定；水产品

中图分类号： TS201.6 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0299-02

收稿日期：2013-10-25

基金项目：湖南省教育厅科研项目（编号：12C0828）；湖南文理学院博士启动项目（2011）；湖南文理学院生命科学学院省级平台开放项目（编号：SKYPT201202）。

作者简介：贺江（1983—），男，江西萍乡人，博士，讲师，主要从事食品安全与食品生物技术研究。E-mail：hejiang1119@163.com。水产养殖业近年来在我国发展迅速，但抗生素残留问题是影响水产养殖业健康发展的瓶颈因素之一[1]。建立有效的残留检测技术体系是对抗生素残留问题进行有效控制的前提与基础。现有的抗生素残留检测方法主要有2类：一类是基于HPLC等精密仪器的标准检测方法[2-3]，但这类方法所用的仪器设备价格昂贵，也不便于现场操作；另一类是基于微生物抑制[4-5]或酶联免疫反应[6]的简便方法，但是微生物抑制法耗时较长，酶联免疫检测法的关键试剂（抗体）制备较困难。因此，建立简便有效的抗生素残留检测方法成为一项被广泛关注且具有较大现实意义和应用价值的研究工作[7]。因此，本研究选取水产养殖中较常用的四环素为对象，依据稀土元素能够增强四环素紫外吸收强度的原理[8]，结合对鱼肉组织样品前处理方案的探讨，建立一种简便有效、可在现场进行操作的四环素残留检测方法。

1材料与方法

1.1材料与试剂

新鲜的鲫鱼（经标准检测方法测定无四环素残留），购自湖南省常德市某农贸市场；四环素标准品，购自德国Dr公司；99% La2O3，购自江西省赣州市科明锐有色金属材料有限公司；色谱甲醇，购自默克公司；其他试剂均为分析纯；试验用水均为超纯水。

1.2仪器与设备

UV-1750紫外-可见分光光度仪（日本岛津公司），TDL-40B 低速离心机，MTN-2800D氮吹仪，匀浆机，HLB固相萃取小柱，微型比色皿，其他常规玻璃器皿。

1.3方法

1.3.1主要试剂的配制

1.3.1.1四环素标准母液精确称取2 mg四环素，加水完全溶解，定容至100 mL，配制成20 μg/mL四环素母液，置于冰箱保存备用。

1.3.1.2EDTA-McIlvaine缓冲溶液称取一定量的Na2EDTA、Na2HPO4 和柠檬酸，分别配制成0.1、0.2、0.4 mol/L的溶液。按照3 ∶2的体积比混合Na2HPO4和柠檬酸，配制成McIlvaine缓冲液。将0.1 mol/L EDTA溶液与McIlvaine缓冲液按照1 ∶1的体积比混合，配制成EDTA-McIlvaine缓冲溶液（混合后pH值约为4）。

1.3.1.3La3+溶液称取0.163 g La2O3，溶于少量浓HCl中，小心蒸发近干，加水定容至100 mL，配制成 10 mmol/L 储备液，保存于冰箱，使用时稀释至1 mmol/L。

1.3.1.4Tris-HCl缓冲溶液将50 mL 0.1 mol/L Tris溶液和38.5 mL 0.1 mol/L HCl溶液混合，定容至 100 mL，此时pH值约为7.6。

1.3.2稀土离子La3+对四环素紫外吸收特性的影响取2份 1 mL四环素母液分别加入到25 mL容量瓶中，其中一份依次加入2.5 mL 1 mmol/L La3+溶液和2.5 mL Tris-HCl缓冲溶液，再加水定容；另一份则加入2.5 mL Tris-HCl缓冲溶液，再加水定容；室温静置30 min后，在200～450 nm波长范围内进行光谱扫描。

1.3.3四环素浓度与紫外吸收强度的线性相关性取不同量的四环素母液于25 mL容量瓶中，再依次加入2.5 mL 1 mmol/L La3+溶液和2.5 mL Tris-HCl缓冲溶液，最后加水定容，使体系中四环素浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、20、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL。室温静置30 min后测定紫外吸光度，并分析四环素浓度与紫外吸光度的相关性。

1.3.4鱼肉组织中四环素残留检测过程

1.3.4.1称样提取将新鲜的鲫鱼洗净，去鳞去皮，除去内脏，剔除鱼骨，将鱼肉置于匀浆机内打碎、拌匀，除去绞不碎的物质。称取5.00 g鱼肉组织于15 mL塑料离心管中，加入 4 mL EDTA-McIlvaine缓冲液均质提取，3 000 r/min离心 5 min，取上清液；鱼肉组织继续用缓冲液提取2次，每次提取 3 mL，并将3次提取液合并。

1.3.4.2净化浓缩将提取液以1滴/s的速度通过预先经5 mL甲醇和5 mL水活化的HLB固相萃取小柱，待上清液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL 甲醇与水的混合液（体积比为5 ∶95）淋洗；弃去全部流出液，用10 mL甲醇洗脱，并收集洗脱液于洁净干燥的离心管中；最后将洗脱液在40 ℃下用氮吹仪浓缩至干。

1.3.4.3溶解测定于上述离心管中加入1 mL 混合液（VLa3+溶液 ∶VTris-HCl缓冲溶液 ∶V水=1 ∶1 ∶8）溶解，摇匀，于室温下静置反应30 min，测定其吸光度。endprint

1.3.5检测方法的灵敏度、准确度和精确度评价

1.3.5.1灵敏度评价将5份空白鱼肉组织（5 g/份）按照“134”所述方法进行处理和吸光度测定，并计算相对标准差，以吸光度为3倍标准差时所对应的四环素残留浓度为方法的检出限。

1.3.5.2准确度评价取3份鱼肉组织（5 g/份），通过添加四环素标准液制备成浓度分别为0.4、0.8、1.2 μg/g模拟样品，静置2 h后，按“1.3.4”节进行处理和测定，并计算加标回收率。

1.3.5.3精确度评价取3份鱼肉组织（5 g/份），通过添加四环素标准液制备成浓度为0.8 μg/g模拟样品，静置2 h后，按“1.3.4”进行处理和计算，并计算变异系数。

2结果与分析

2.1稀土离子La3+对四环素紫外吸收特性的影响

通过对照试验分析了La3+对四环素紫外吸收特性的影响，结果如图1所示。由图1可知，四环素与稀土离子La3+作用后，其紫外吸收特性发生明显改变。一方面最大吸收峰的位置由350 nm移至390～392 nm，并且峰型呈“平台”状；另一方面最大吸收峰处的吸光度明显增大。其原因在于，四环素分子具有一定的共轭体系，其本身在350 nm附近的紫外区有1个弱的吸收带，当它与稀土离子反应形成络合物后，在配位场的作用下，在吸光度增加的同时，其电子迁跃的激发能减弱，吸收带红移到390 nm处。La3+对四环素紫外吸收特性的改变有利于四环素残留定量检测方法的建立，“平台”状峰型有利于提高检测的稳定性；而吸光度的增加则有利于提高检测灵敏度。

2.2四环素浓度与紫外吸收强度的线性相关性

在确定了La3+对四环素紫外吸收特性影响的基础上，试验进一步分析了四环素浓度在0.2～10.0 μg/mL范围内变化时，待测物浓度与吸光度之间的相关性，结果如图2所示。由图2可知，随着检测体系中四环素浓度的增大，其最大吸收峰处的吸光度逐渐增大，对数据作进一步回归分析后发现，二者呈良好的线性关系。说明四环素浓度与紫外吸光度的关系符合“朗伯比尔定律”，该体系可用于四环素残留的定量检测；经计算，最大吸收峰处（390 nm）的摩尔吸光系数（ε）为14 400 L/（mol·cm）。

2.3鱼肉组织中四环素残留浓度的测定效果

实际样品中的残留检测效果除了与最终的测定方法相关外，还与样品的前处理方法密切相关。本研究制备了不同四环素残留浓度的模拟样品，按“1.3.4”所述的样品处理方案处理后进行吸光度测定，将四环素残留浓度与相应吸光度进行回归分析，结果如图3所示。由图3可知，鱼肉组织中四环素残留浓度与样品吸光度也呈良好的相关性，说明可以利用该方法进行四环素残留检测。

2.4检测方法的灵敏度、准确度和精密度评价

按照上述方法，对5份空白鱼肉组织进行测定，其吸光度为0.007 8±0.003 4，以3倍标准差（即0.010 2）带入“2.3”中的回归方程，求得该检测方法的最低检测限为0.095 μg/g。对3份添加浓度分别为0.4、0.8、1.2μg/g模拟样品进行测

定，测得回收率在80%～110%之间，说明该检测方法的准确性良好。对添加浓度为0.8 μg/g的3份模拟样品进行测定，其添加回收率稳定，相对标准差为3.09%，说明该方法精密度较高。

3结论与讨论

利用紫外-可见分光光度法进行定量分析具有操作简便的特点，但是其检测灵敏度通常难以满足药物残留检测的要求。本研究从检测方法本身和配套前处理方案2个方面考虑，以提高检测效果。在检测方法上，通过在检测体系中引入稀土离子La3+，使四环素的紫外吸光度增大，进而提高检测灵敏度。在样品前处理方案方面，通过对提取液进行净化以消除基质干扰，提高检测稳定性；利用空白基质液配置标准物质进而制作标准曲线，以提高检测的准确性；对提取液进行浓缩（配合使用微量比色皿）进一步提高检测的灵敏度。本研究所建立方法的最低检出限为0.095 μg/g，虽然与HPLC、GC等方法的灵敏度仍有较大差距，但低于我国相关法规规定的水产品中四环素最大残留限量（0.1 μg/g）[9]，说明该方法能够满足作为现场初筛（阴性/阳性判别）手段的要求。

参考文献：

[1]朱岗，高会平. 介绍一种新型水产环保型抗菌素——中鱼尼考[J]. 中国水产，2002（10）：85.

[2]袁冬梅，李一婧. 养殖水产品中四环素类抗生素残留的高效液相色谱测定法[J]. 食品工业科技，2008（1）：281，285.

[3]朱世超，钱卓真，吴成业. 水产品中7种大环内酯类抗生素残留量的HPLC-MS/MS测定法[J]. 南方水产科学，2012，8（1）：54-60.

[4]黄晓蓉，郑晶，吴谦，等. 食品中多种抗生素残留的微生物筛检方法研究[J]. 食品科学，2007，28（8）：418-421.

[5]陈树桥，周国勤，陈桂芳，等. 水产品中抗生素药物残留检测平板的制备研究[J]. 江苏农业科学，2006（3）：177-179.

[6]刘智宏，叶妮，郭文林，等. 四环素类药物多残留酶联免疫检测方法[J]. 中国农业科学，2009，42（1）：318-323.

[7]叶兴乾，刘东红，陈健初. 牛奶抗生素残留快速检测技术进展及应用现状[J]. 农业工程学报，2005，21（4）：181-185.

[8]江虹，刘绍璞，胡小莉，等. 稀土与四环素类抗生素络合物的光度法研究[J]. 分析化学，2003，31（10）：1207-1211.

[9]动物性食品中兽药最高残留限量[J]. 中国猪业，2010（8）：10-12.endprint

1.3.5检测方法的灵敏度、准确度和精确度评价

1.3.5.1灵敏度评价将5份空白鱼肉组织（5 g/份）按照“134”所述方法进行处理和吸光度测定，并计算相对标准差，以吸光度为3倍标准差时所对应的四环素残留浓度为方法的检出限。

1.3.5.2准确度评价取3份鱼肉组织（5 g/份），通过添加四环素标准液制备成浓度分别为0.4、0.8、1.2 μg/g模拟样品，静置2 h后，按“1.3.4”节进行处理和测定，并计算加标回收率。

1.3.5.3精确度评价取3份鱼肉组织（5 g/份），通过添加四环素标准液制备成浓度为0.8 μg/g模拟样品，静置2 h后，按“1.3.4”进行处理和计算，并计算变异系数。

2结果与分析

2.1稀土离子La3+对四环素紫外吸收特性的影响

通过对照试验分析了La3+对四环素紫外吸收特性的影响，结果如图1所示。由图1可知，四环素与稀土离子La3+作用后，其紫外吸收特性发生明显改变。一方面最大吸收峰的位置由350 nm移至390～392 nm，并且峰型呈“平台”状；另一方面最大吸收峰处的吸光度明显增大。其原因在于，四环素分子具有一定的共轭体系，其本身在350 nm附近的紫外区有1个弱的吸收带，当它与稀土离子反应形成络合物后，在配位场的作用下，在吸光度增加的同时，其电子迁跃的激发能减弱，吸收带红移到390 nm处。La3+对四环素紫外吸收特性的改变有利于四环素残留定量检测方法的建立，“平台”状峰型有利于提高检测的稳定性；而吸光度的增加则有利于提高检测灵敏度。

2.2四环素浓度与紫外吸收强度的线性相关性

在确定了La3+对四环素紫外吸收特性影响的基础上，试验进一步分析了四环素浓度在0.2～10.0 μg/mL范围内变化时，待测物浓度与吸光度之间的相关性，结果如图2所示。由图2可知，随着检测体系中四环素浓度的增大，其最大吸收峰处的吸光度逐渐增大，对数据作进一步回归分析后发现，二者呈良好的线性关系。说明四环素浓度与紫外吸光度的关系符合“朗伯比尔定律”，该体系可用于四环素残留的定量检测；经计算，最大吸收峰处（390 nm）的摩尔吸光系数（ε）为14 400 L/（mol·cm）。

2.3鱼肉组织中四环素残留浓度的测定效果

实际样品中的残留检测效果除了与最终的测定方法相关外，还与样品的前处理方法密切相关。本研究制备了不同四环素残留浓度的模拟样品，按“1.3.4”所述的样品处理方案处理后进行吸光度测定，将四环素残留浓度与相应吸光度进行回归分析，结果如图3所示。由图3可知，鱼肉组织中四环素残留浓度与样品吸光度也呈良好的相关性，说明可以利用该方法进行四环素残留检测。

2.4检测方法的灵敏度、准确度和精密度评价

按照上述方法，对5份空白鱼肉组织进行测定，其吸光度为0.007 8±0.003 4，以3倍标准差（即0.010 2）带入“2.3”中的回归方程，求得该检测方法的最低检测限为0.095 μg/g。对3份添加浓度分别为0.4、0.8、1.2μg/g模拟样品进行测

定，测得回收率在80%～110%之间，说明该检测方法的准确性良好。对添加浓度为0.8 μg/g的3份模拟样品进行测定，其添加回收率稳定，相对标准差为3.09%，说明该方法精密度较高。

3结论与讨论

利用紫外-可见分光光度法进行定量分析具有操作简便的特点，但是其检测灵敏度通常难以满足药物残留检测的要求。本研究从检测方法本身和配套前处理方案2个方面考虑，以提高检测效果。在检测方法上，通过在检测体系中引入稀土离子La3+，使四环素的紫外吸光度增大，进而提高检测灵敏度。在样品前处理方案方面，通过对提取液进行净化以消除基质干扰，提高检测稳定性；利用空白基质液配置标准物质进而制作标准曲线，以提高检测的准确性；对提取液进行浓缩（配合使用微量比色皿）进一步提高检测的灵敏度。本研究所建立方法的最低检出限为0.095 μg/g，虽然与HPLC、GC等方法的灵敏度仍有较大差距，但低于我国相关法规规定的水产品中四环素最大残留限量（0.1 μg/g）[9]，说明该方法能够满足作为现场初筛（阴性/阳性判别）手段的要求。

参考文献：

[1]朱岗，高会平. 介绍一种新型水产环保型抗菌素——中鱼尼考[J]. 中国水产，2002（10）：85.

[2]袁冬梅，李一婧. 养殖水产品中四环素类抗生素残留的高效液相色谱测定法[J]. 食品工业科技，2008（1）：281，285.

[3]朱世超，钱卓真，吴成业. 水产品中7种大环内酯类抗生素残留量的HPLC-MS/MS测定法[J]. 南方水产科学，2012，8（1）：54-60.

[4]黄晓蓉，郑晶，吴谦，等. 食品中多种抗生素残留的微生物筛检方法研究[J]. 食品科学，2007，28（8）：418-421.

[5]陈树桥，周国勤，陈桂芳，等. 水产品中抗生素药物残留检测平板的制备研究[J]. 江苏农业科学，2006（3）：177-179.

[6]刘智宏，叶妮，郭文林，等. 四环素类药物多残留酶联免疫检测方法[J]. 中国农业科学，2009，42（1）：318-323.

[7]叶兴乾，刘东红，陈健初. 牛奶抗生素残留快速检测技术进展及应用现状[J]. 农业工程学报，2005，21（4）：181-185.

[8]江虹，刘绍璞，胡小莉，等. 稀土与四环素类抗生素络合物的光度法研究[J]. 分析化学，2003，31（10）：1207-1211.

[9]动物性食品中兽药最高残留限量[J]. 中国猪业，2010（8）：10-12.endprint

1.3.5检测方法的灵敏度、准确度和精确度评价

1.3.5.1灵敏度评价将5份空白鱼肉组织（5 g/份）按照“134”所述方法进行处理和吸光度测定，并计算相对标准差，以吸光度为3倍标准差时所对应的四环素残留浓度为方法的检出限。

1.3.5.2准确度评价取3份鱼肉组织（5 g/份），通过添加四环素标准液制备成浓度分别为0.4、0.8、1.2 μg/g模拟样品，静置2 h后，按“1.3.4”节进行处理和测定，并计算加标回收率。

1.3.5.3精确度评价取3份鱼肉组织（5 g/份），通过添加四环素标准液制备成浓度为0.8 μg/g模拟样品，静置2 h后，按“1.3.4”进行处理和计算，并计算变异系数。

2结果与分析

2.1稀土离子La3+对四环素紫外吸收特性的影响

通过对照试验分析了La3+对四环素紫外吸收特性的影响，结果如图1所示。由图1可知，四环素与稀土离子La3+作用后，其紫外吸收特性发生明显改变。一方面最大吸收峰的位置由350 nm移至390～392 nm，并且峰型呈“平台”状；另一方面最大吸收峰处的吸光度明显增大。其原因在于，四环素分子具有一定的共轭体系，其本身在350 nm附近的紫外区有1个弱的吸收带，当它与稀土离子反应形成络合物后，在配位场的作用下，在吸光度增加的同时，其电子迁跃的激发能减弱，吸收带红移到390 nm处。La3+对四环素紫外吸收特性的改变有利于四环素残留定量检测方法的建立，“平台”状峰型有利于提高检测的稳定性；而吸光度的增加则有利于提高检测灵敏度。

2.2四环素浓度与紫外吸收强度的线性相关性

在确定了La3+对四环素紫外吸收特性影响的基础上，试验进一步分析了四环素浓度在0.2～10.0 μg/mL范围内变化时，待测物浓度与吸光度之间的相关性，结果如图2所示。由图2可知，随着检测体系中四环素浓度的增大，其最大吸收峰处的吸光度逐渐增大，对数据作进一步回归分析后发现，二者呈良好的线性关系。说明四环素浓度与紫外吸光度的关系符合“朗伯比尔定律”，该体系可用于四环素残留的定量检测；经计算，最大吸收峰处（390 nm）的摩尔吸光系数（ε）为14 400 L/（mol·cm）。

2.3鱼肉组织中四环素残留浓度的测定效果

实际样品中的残留检测效果除了与最终的测定方法相关外，还与样品的前处理方法密切相关。本研究制备了不同四环素残留浓度的模拟样品，按“1.3.4”所述的样品处理方案处理后进行吸光度测定，将四环素残留浓度与相应吸光度进行回归分析，结果如图3所示。由图3可知，鱼肉组织中四环素残留浓度与样品吸光度也呈良好的相关性，说明可以利用该方法进行四环素残留检测。

2.4检测方法的灵敏度、准确度和精密度评价

按照上述方法，对5份空白鱼肉组织进行测定，其吸光度为0.007 8±0.003 4，以3倍标准差（即0.010 2）带入“2.3”中的回归方程，求得该检测方法的最低检测限为0.095 μg/g。对3份添加浓度分别为0.4、0.8、1.2μg/g模拟样品进行测

定，测得回收率在80%～110%之间，说明该检测方法的准确性良好。对添加浓度为0.8 μg/g的3份模拟样品进行测定，其添加回收率稳定，相对标准差为3.09%，说明该方法精密度较高。

3结论与讨论

利用紫外-可见分光光度法进行定量分析具有操作简便的特点，但是其检测灵敏度通常难以满足药物残留检测的要求。本研究从检测方法本身和配套前处理方案2个方面考虑，以提高检测效果。在检测方法上，通过在检测体系中引入稀土离子La3+，使四环素的紫外吸光度增大，进而提高检测灵敏度。在样品前处理方案方面，通过对提取液进行净化以消除基质干扰，提高检测稳定性；利用空白基质液配置标准物质进而制作标准曲线，以提高检测的准确性；对提取液进行浓缩（配合使用微量比色皿）进一步提高检测的灵敏度。本研究所建立方法的最低检出限为0.095 μg/g，虽然与HPLC、GC等方法的灵敏度仍有较大差距，但低于我国相关法规规定的水产品中四环素最大残留限量（0.1 μg/g）[9]，说明该方法能够满足作为现场初筛（阴性/阳性判别）手段的要求。

参考文献：

[1]朱岗，高会平. 介绍一种新型水产环保型抗菌素——中鱼尼考[J]. 中国水产，2002（10）：85.

[2]袁冬梅，李一婧. 养殖水产品中四环素类抗生素残留的高效液相色谱测定法[J]. 食品工业科技，2008（1）：281，285.

[3]朱世超，钱卓真，吴成业. 水产品中7种大环内酯类抗生素残留量的HPLC-MS/MS测定法[J]. 南方水产科学，2012，8（1）：54-60.

[4]黄晓蓉，郑晶，吴谦，等. 食品中多种抗生素残留的微生物筛检方法研究[J]. 食品科学，2007，28（8）：418-421.

[5]陈树桥，周国勤，陈桂芳，等. 水产品中抗生素药物残留检测平板的制备研究[J]. 江苏农业科学，2006（3）：177-179.

[6]刘智宏，叶妮，郭文林，等. 四环素类药物多残留酶联免疫检测方法[J]. 中国农业科学，2009，42（1）：318-323.

[7]叶兴乾，刘东红，陈健初. 牛奶抗生素残留快速检测技术进展及应用现状[J]. 农业工程学报，2005，21（4）：181-185.

[8]江虹，刘绍璞，胡小莉，等. 稀土与四环素类抗生素络合物的光度法研究[J]. 分析化学，2003，31（10）：1207-1211.

[9]动物性食品中兽药最高残留限量[J]. 中国猪业，2010（8）：10-12.endprint