氨基酸对NaCl胁迫下棉苗生理性状及脯氨酸含量的影响

2014-09-02杜娟申磊孙艳香

江苏农业科学 2014年7期

杜娟　申磊　孙艳香

摘要：为了研究不同氨基酸不同浓度对NaCl胁迫下棉苗生理性状和脯氨酸含量的影响，采用温室培养处理，将2、4、6、8 mmol/L氨基酸与1 mol/L NaCl溶液混合后浸泡处理棉籽24 h，同设单独盐处理及水处理，10 d后测定棉苗生理指标和脯氨酸含量。结果显示，8 mmol/L瓜氨酸处理的发芽率比1 mol/L NaCl处理高很多；鸟氨酸处理的棉籽发芽势基本都高于NaCl处理中棉籽的发芽势，不同种类不同浓度氨基酸浸种对NaCl胁迫下棉花幼苗鲜质量、干质量及含水量均有不同程度的影响；所有氨基酸处理对NaCl胁迫下棉花中脯氨酸的生成均有一定的抑制作用。说明部分种类及浓度的氨基酸能缓解盐胁迫对棉籽萌发及棉花幼苗生长的抑制作用，而对脯氨酸的生成有不同程度的抑制作用。

关键词：氨基酸；棉花；生理性状；NaCl胁迫；脯氨酸

中图分类号： S562.01 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0099-03

收稿日期：2014-02-19

基金项目：河北省教育厅项目（编号：Z2013014）；河北省廊坊市科学技术研究与发展计划（编号：2013012003）。

作者简介：杜娟（1983—），女，河北冀州人，硕士，助理研究员，主要从事植物保护方面的研究。E-mail：dujuan0203@163.com。

通信作者：孙艳香，博士，教授，主要从事植物转基因遗传方面的研究。Tel：（0316）2188092；E-mail：yx_sun70@163.com。 NaCl胁迫会造成植物发育迟缓，抑制植物组织和器官的生长和分化[1]。氨基酸能帮助植物对一些逆境作出反应，防止叶绿体光合作用的衰减[2-3]等多种生理过程。中国盐渍土的比例明显高于世界平均水平，提高植物耐盐性是克服土壤盐渍化的一条重要途径[4-5]。因此，研究NaCl胁迫下氨基酸与植物耐盐性的关系具有重要意义。目前，关于氨基酸参与植物胁迫适应的研究主要包括盐胁迫抵抗力、调节膨压渗透势和阳离子膜运输等[6-10]；还有文献报道氨基酸能够提高植物对盐胁迫的适应能力，进而提高植物的耐盐能力[11]；近期有研究表明，NaCl处理严重抑制了棉苗节间伸长和叶面积的扩展，减慢了生长速率，降低了干物质积累，NaCl浓度越高，胁迫症状出现得越早[12]。本研究以棉花为材料，研究NaCl胁迫下不同种类不同浓度的氨基酸对棉花幼苗生理性状的影响以及棉花幼苗中脯氨酸含量的变化，探讨氨基酸缓解棉花在NaCl胁迫下的生理生化机理，以期为扩大棉花在盐渍地中的种植面积、进一步提高棉花产量提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

供试陆地棉（Gossypium hirsutum L.）品种为农大棉7号。

1.2研究方法

1.2.1试材培育及测定棉籽经硫酸脱绒，清水冲洗干净后晾干，精选外观饱满、大小与色泽等一致的棉籽，浸种[本试验中设3种氨基酸4个含量水平（分别与1 mol/L NaCl溶液混合后浸泡处理棉籽）以及水处理（水对照）、NaCl处理（盐对照）共18个处理]至露白，选露白一致的棉籽，与草炭土 ∶珍珠岩 ∶蛭石=1 ∶1 ∶1混合于90 mm×70 mm 培养钵中，封上塑料膜，在光照培养室内育苗，昼温约25 ℃，夜温约20 ℃，光强400 μmol/（m2·s）。每天每盆浇相同量的水，于相同条件下培养，其他管理措施如病虫害防治等相同。

自发芽开始每天记录发芽数，第7天统计发芽势，第10天统计发芽率。第10天洗出完整植株，快速擦干，称得鲜质量，并测量苗髙与根长。将棉苗放入烘箱以80 ℃烘干至恒重，然后称得干质量，记录并统计所得数据。

1.2.2脯氨酸含量的测定

1.2.2.1标准曲线的绘制在分析天平上精确称取25 mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中含脯氨酸100 μg/mL；取6个50 mL容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸含量分别为1、2、3、4、5、6 μg/mL。取6支试管，分别吸取2 mL系列标准含量的脯氨酸溶液及2 mL冰醋酸和 2 mL 酸性茚三酮溶液，每支试管在沸水浴中加热30 min；冷却后，各试管中准确加入4 mL甲苯，振荡30 s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液；用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520 nm波长处进行比色。先求出吸光度（y）依脯氨酸含量（x）变化而变化的回归方程，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2 mL待测液中脯氨酸的含量。

1.2.2.2样品的测定（1）脯氨酸的提取。待棉花幼苗长出2～3张真叶时取叶片，并测定各处理叶片中的脯氨酸含量。准确称取不同处理的待测棉花真叶叶片各0.5 g，分别置于大管中，然后向各管中分别加入5 mL 3%磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取 10 min （提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。（2）吸取 2 mL 提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2 mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30 min，溶液即呈红色。冷却后加入 4 mL 甲苯，摇荡30 s，静置片刻，取上层液至10 mL离心管中，在3 000 r/min下离心5 min。（3）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，用分光光度计在520 nm波长处比色，求得吸光度。

1.2.2.3结果计算根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2 mL测定液中脯氨酸质量（x），然后计算干样品中脯氨酸含量：脯氨酸含量（μg/g）=52x/样品质量（g）。

2结果与分析

2.1氨基酸浸种对NaCl胁迫下棉花幼苗生理性状的影响

2.1.1氨基酸浸种对NaCl胁迫下棉籽发芽的影响由图1可以看出，NaCl处理的棉籽发芽率明显低于水处理，而不同种类、同种类不同浓度的氨基酸浸种对棉籽的发芽率也有一定的影响。用3种浓度氨基酸浸种后的棉籽发芽率均低于水处理，所有浓度精氨酸处理的棉籽发芽率均低于NaCl处理，8 mmol/L 瓜氨酸处理比NaCl处理略高一些，2、6 mmol/L鸟氨酸处理的棉籽发芽率高于NaCl处理。由此可知，在1 mol/L NaCl胁迫下，用瓜氨酸和鸟氨酸浸种对棉籽具有一定的缓解作用，而精氨酸对棉籽的缓解作用较小。

由图2可以看出，NaCl处理棉籽的发芽势明显低于水处理，而精氨酸处理的棉籽发芽势均比NaCl处理低，鸟氨酸处理的棉籽发芽势基本都高于NaCl处理，瓜氨酸处理的棉籽发芽势只有在浓度为8 mmol/L时才高于NaCl处理。由此可知，用不同种类、不同浓度的氨基酸浸种对NaCl胁迫下的棉籽发芽势影响不同，经鸟氨酸浸种处理后的棉籽发芽势较高，而经精氨酸浸种的棉籽发芽势较NaCl处理低，说明精氨酸缓解盐胁迫的作用并不明显。

2.1.2氨基酸浸种对盐胁迫下棉花幼苗生长的影响由表1可知，精氨酸处理组中，水对照，2、4 mmol/L精氨酸处理的棉花苗高与NaCl处理差异显著，6、8 mmol/L精氨酸与NaCl处理差异不显著；瓜氨酸处理组中，水处理与6 mmol/L瓜氨酸处理苗高差异显著，与其他浓度处理差异不显著；鸟氨酸处理中除浓度为4 mmol/L的棉花外，其他处理的棉花苗均比NaCl处理高，与水处理和NaCl处理苗高差异不显著。

从表1还可以看出，精氨酸处理的棉花根长均比NaCl处理的短，均与水处理差异显著，只有4、6 mmol/L精氨酸处理的棉花根长与NaCl处理差异显著。瓜氨酸处理的根长均与水处理差异显著；只有6 mmol/L瓜氨酸处理的根长比NaCl处理短且差异显著，其他处理的根长均大于NaCl处理但差异不显著。鸟氨酸处理中只有浓度为2 mmol/L处理的棉花根长大于NaCl处理，与水处理和NaCl处理差异均不显著；其他处理均与水处理和NaCl处理差异显著。

3结论与讨论

一般认为，棉花耐盐能力在萌发出苗阶段最弱，随着生育进程的进行不断增强。在沿海滩涂地区，成苗难是棉花生产上尚未解决而亟待解决的问题。由于棉花幼苗对盐分比较敏感，因此根系发育的好坏影响根系对水分和养分的吸收，对棉苗的耐盐性尤其重要[13-14]。有研究认为，盐胁迫可以增加根系分泌物中氨基酸的种类和含量。随着盐胁迫浓度的增大和黄瓜生长时间的延长，各处理用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）检出的化合物种类和总含量呈减少的趋势[15]。

本研究结果表明，在相同浓度NaCl胁迫下，有几个浓度的氨基酸浸种处理后使棉花幼苗根长略大于NaCl处理，但其他几个浓度处理的根长甚至有远小于NaCl处理棉花根长的现象。由此推测，棉花根部存在一个耐NaCl阈值，当土壤中NaCl浓度在阈值范围内时，棉花根长与土壤NaCl浓度呈正比关系；当超出阈值时，棉花根部会因受NaCl胁迫而受到影响，从而根长减小，而不同种类、不同浓度的氨基酸处理可以不同程度提高耐盐阈值。这个推测是否成立，尚待论证。

同时，在对本研究中所得各组棉花叶片的脯氨酸含量进行分析以及与预期结果进行对比后发现，氨基酸浸种并未很大程度地提升NaCl胁迫下棉花幼苗中的脯氨酸含量，甚至经氨基酸浸种后棉花叶片中脯氨酸含量少于NaCl处理。有大量研究表明，脯氨酸的大量积累是高等植物受NaCl胁迫等渗透胁迫时的正常生理生化现象，因为在渗透胁迫下，脯氨酸既作为渗透调节剂维持低水势，又保护生物大分子不受NaCl离子的毒害[16]。本研究中脯氨酸在经氨基酸浸种后的生成会受到抑制，是因为脯氨酸的生成主要有2个途径：谷氨酸途径和鸟氨酸途径，而鸟氨酸又可与精氨酸、瓜氨酸形成一个循环途径[17]。由此可知，当棉花受到盐胁迫时，其体内会生成大量脯氨酸以保证自己的正常生长发育，然而当对其以精氨酸、鸟氨酸或瓜氨酸进行处理后，合成脯氨酸的重要途径——鸟氨酸途径会受到抑制，从而使脯氨酸的合成受到抑制，最终使其脯氨酸含量小于NaCl胁迫下未经氨基酸处理的棉花。

本试验从棉籽萌发、棉花幼苗生长及棉花叶片中脯氨酸的含量几个方面比较了经氨基酸浸种与未经氨基酸浸种的棉花受NaCl胁迫时的差异，从而发现不同浓度的瓜氨酸、鸟氨酸、精氨酸对缓解棉花NaCl胁迫的作用不同。总的来说，部分种类、部分浓度的氨基酸能缓解NaCl胁迫对棉籽萌发及棉花幼苗生长的抑制作用，精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸浸种对棉花植株中脯氨酸的生成有不同程度的抑制作用。

参考文献：

[1]杨少辉，季静，王罡，等. 盐胁迫对植物影响的研究进展[J]. 分子植物育种，2006，4（增刊）：139-142.

[2]柯玉琴，潘廷国. NaCl 胁迫对甘薯叶片叶绿体超微结构及一些酶活性的影响[J]. 植物生理学报，1999，25（3）：229-233，315-316.

[3]陈洁，林栖凤. 植物耐盐生理及耐盐机理研究进展[J]. 海南大学学报：自然科学版，2003，21（2）：177-182.

[4]魏国强，朱祝军，方学智，等. NaCl胁迫对不同品种黄瓜幼苗生长、叶绿素荧光特性和活性氧代谢的影响[J]. 中国农业科学，2004，37（11）：1754-1759.

[5]郭文忠，刘声锋，李丁仁，等. 设施蔬菜土壤次生盐渍化发生机理的研究现状与展望[J]. 土壤，2004，36（1）：25-29.

[6]Sharma S S，Dietz K J. The significance of amino acids and amino acid-derived molecules in plant responses and adaptation to heavy metal stress[J]. Journal of Experimental Botany，2006，57（4）：711-726.

[7]Rai V K. Role of amino acids in plant responses to stresses[J]. Biologia Plantarum，2002，45（4）：481-487.

[8]Szabados L，Savouré A. Proline：a multifunctional amino acid[J]. Trends in Plant Science，2010，15（2）：89-97.

[9]El S A，Shaddad M A K，Barakat N.Improbement of plants salt tolerance by exogenous application of amino acids[J]. Plants Resour，2011，5（24）：5692-5699.

[10]Székely G，Abrahám E，Cséplo A，et al. Duplicated P5CS genes of Arabidopsis play distinct roles in stress regulation and developmental control of proline biosynthesis[J]. The Plant Journal：for Cell and Molecular Biology，2008，53（1）：11-28.

[11]Khedr A H，Abbas M A，Wahid A A，et al. Proline induces the expression of salt-stress-responsive proteins and may improve the adaptation of Pancratium maritimum L. to salt-stress[J]. Journal of Experimental Botany，2003，54（392）：2553-2562.

[12]李翠芳，刘连涛，孙红春，等. 外源NO对NaCl胁迫下棉苗主要形态和相关生理性状的影响[J]. 中国农业科学，2012，45（9）：1864-1872.

[13]蒋玉蓉，吕有军，祝水金. 棉花耐盐机理与盐害控制研究进展[J]. 棉花学报，2006，18（4）：248-254.

[14]王俊娟，叶武威，周大云，等. 盐胁迫下不同耐盐类型棉花的萌发特性[J]. 棉花学报，2007，19（4）：315-317.

[15]吴凤芝，周新刚，包静. NaCl胁迫对不同耐盐黄瓜品种根系分泌物主要成分的影响[J]. 中国农业科学，2012，45（21）：4415-4427.

[16]许祥明，叶和春，李国凤. 脯氨酸代谢与植物抗渗透胁迫的研究进展[J]. 植物学通报，2000，17（6）：536-542.

[17]谢虹，杨兰，李忠光. 脯氨酸在植物非生物胁迫耐性形成中的作用[J]. 生物技术通报，2011（2）：23-27，60.