正交设计优化油松ISSR—PCR反应体系

王树香　李明　高宝嘉

摘要：采用正交设计的方法对油松ISSR-PCR反应体系5因素（Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物的浓度）在4水平上进行优化试验，PCR结果用SPSS数据软件分析。结果表明：各因素不同水平对PCR反应结果都有显著的影响，且除dNTP因素外其他4因素影响均较大；筛选出各反应因素的最佳水平，建立油松ISSR-PCR的最佳反应体系（20 μL）为：Taq DNA聚合酶1 U、模板5 μg/μL、Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTP 0.20 mmol/L、引物0.4 μmol/L；进行梯度退火试验，筛选出针对不同引物的最适的油松ISSR退火温度。该优化体系的建立为油松及其近缘种的系统学和种质资源鉴定及遗传多样性的研究奠定基础。

关键词：油松；分子标记；ISSR-PCR；反应体系；正交设计

中图分类号： S722.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0046-04

收稿日期：2013-11-01

基金项目：河北省自然科学基金（编号：C2008000231）；河北农业大学科研基金（编号：QJ201230）。

作者简介：王树香（1977—），女，河北唐山人，硕士，实验师，主要从事微生物学、分子生态学研究。Tel：（0312）7528256；E-mail：wangshuxiang77@163.com。

通信作者：高宝嘉，博士，教授，主要从事生态学、森林有害生物管理研究。E-mail：baojiagao@163.com。油松（Pinus tabulaeformis）为我国特有树种，是我国温带针叶林中主要的建群树种，在工业用材、城镇绿化和荒山造林中具有重要的价值。就目前研究的相关资料来看，国内关于油松的遗传多样性和遗传结构的研究较多。如李毳等利用RAPD、ISSR（inter simple sequence repeat，简单重复序列区间）等分子标记方法对天然油松群体作了遗传多样性分析[1-4]；郝真真等从表观上对ISSR-PCR进行了优化，并研究了油松种群遗传多样性和空间遗传结构特征[5]。ISSR分子标记技术具有多态性水平高、可重复性好、DNA用量少、成本低等优点，广泛用于群体遗传多样性分析和种质鉴别等研究[6-13]。但是，采用正交设计的方法对油松ISSR-PCR反应体系进行优化还无报道，因此，本试验利用正交设计从Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、模板DNA、Mg2+等5个因素4个水平进行分析，优化并建立油松ISSR-PCR反应体系，从而提高ISSR分析结果的可靠性和重复性，为油松品种的分子鉴定、遗传多样性分析和品种改良奠定试验基础。

1材料与方法

1.1材料

油松选于河北省辽河源国家级森林公园（北纬41°00′～41°10′、东经118°30′～118°40′），采集当年生针叶置于冰盒中带回实验室，置于-70 ℃超低温冰箱中保存备用。试验用Taq DNA聚合酶、dNTP购自上海宝生科技发展有限公司，引物（USB811）由上海宝生科技发展有限公司合成。

1.2基因组DNA提取和PCR扩增

采用UNIQ-10 柱式新型植物基因组DNA抽提试剂盒[购自生工生物工程（上海）股份有限公司]从油松叶片中提取多株植物基因组总DNA，提取的DNA作为ISSR-PCR反应体系的模板。所提DNA样品的纯度和含量用紫外吸收和0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3PCR反应因素的确定与正交表的设计

为了确定PCR反应中5个因素（Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物）的最佳反应浓度，采用正交设计L16（45）于4个水平上进行试验，每个处理重复2次，每个处理体积均为20 μL（表1），其中加入2.0 μL无Mg2+的10×Buffer，其他成分按照正交设计所分析的浓度加入，不足 20 μL 的用超纯水补足。16个处理在美国ABI 2720型PCR仪上进行扩增，反应程序初步定为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃再延伸7 min；4 ℃保温。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶在 3 V/cm 电压下电泳，电泳结果采用BIO-RAD Doc-2000自动凝胶成像系统成像，并用SPSS 18.0软件进行方差分析，进而获得油松ISSR-PCR最佳反应条件。

1.4退火温度梯度检测

在正交试验结果分析的基础上，利用扩增仪进行PCR反应程序中退火温度梯度试验，退火温度设置为46～55 ℃，扩增仪自动生成46.0、49.0、52.0、55.0 ℃等4个温度梯度。所用的PCR扩增体系为正交设计所得出的最佳体系。

2结果与分析

2.1电泳结果评分

正交试验PCR产物电泳结果见图1，获得的16个处理的谱带结果存在很大差异。参照何正文等的方法[14]，依据谱带强弱和杂带的多少对PCR扩增结果依次打分。其中，条带数量多、清晰的扩增结果计16分，最差的计1分。2次重复分别独立统计，16个处理的分数见表1。

2.2各因素对ISSR-PCR反应影响的差异分析

将上述处理和评分结果用SPSS数据处理软件进行方差分析，结果见表2。由F值可知，模版DNA的浓度对反应结果的影响最大，dNTPs浓度的影响最小，各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次为模板DNA的浓度、Taq DNA聚合酶的浓度、引物的浓度、Mg2+的浓度、dNTPs的浓度。由于各因素水平间的差异除dNTPs和Mg2+的浓度外均达到了显著水平，可以进一步进行因素内水平间的多重比较（表3）。

试验中模板DNA对反应体系影响显著，这与白锦军等的研究结果[15]相似，但与吴根土等的研究结果[16-17]相反，其原因可能是因为模板DNA中含有酚、多糖等杂质，会抑制Taq DNA聚合酶活性，从而影响结果，因此说明高质量的基因组DNA是获得稳定ISSR-PCR结果的前提。在油松的 ISSR-PCR 反应体系中，Taq DNA聚合酶、Mg2+和引物的浓度对PCR扩增结果影响显著，这与前人的研究结果[18-19]相同。本试验结果显示dNTPs的浓度变化对PCR结果影响不显著，这不同于其他研究结果[20-21]，分析其原因可能是单因素梯度试验结果的分析未考虑其他因素的交叉影响，造成不可避免的试验误差，而本试验采用正交试验方差分析，从而提高了分析结果的可靠性。

本试验构建的油松ISSR-PCR最佳反应体系中，除模板DNA浓度偏高外，Taq DNA聚合酶量、Mg2+浓度、引物浓度、dNTPs浓度均与其他亲缘相近树种相似，如红松[22]、云南松[23]等。ISSR反应对某些物种模板DNA浓度不太敏感，但本研究结果显示影响是极显著的，也与贺佳等的研究结果[24]相同。退火温度在减少模板与引物间的非特异性结合，进而提高PCR反应的特异性方面具有重要作用，因此本试验对筛选出的14条引物逐个进行退火温度梯度试验，确定每个引物的最适退火温度，为以后相似研究提供参考。本试验优化的稳定ISSR反应体系可以为油松品种选育奠定基础，同时对油松种质资源鉴定、亲缘关系分析、遗传多样性分析、遗传图谱构建等领域提供科学依据。

参考文献：

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