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鹅副黏病毒F基因的克隆和序列分析

2014-09-02吴民

江苏农业科学 2014年7期
关键词:序列分析克隆

摘要:为了深入研究鹅副黏病毒(goose paramyxovirus,GPMV)F基因的功能,利用PCR方法克隆了鹅副黏病毒HN株的F基因,将其与pMD18-T载体连接后转化到感受态大肠杆菌DH5α中,经PCR鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析。结果表明:鹅副黏病毒HN株的F基因全长均为1 662 bp,编码553个氨基酸,其裂解位点的氨基酸序列为112-Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe-117,与已公布的强毒株裂解位点的氨基酸序列相符。

关键词:鹅副黏病毒;F基因;克隆;序列分析

中图分类号: Q785;S858.335.3 文献标志码: A 文章编号:1002-1302(2014)07-0035-02

收稿日期:2013-09-27

作者简介:吴民(1964—),男,海南海口人,兽医师,主要从事畜牧兽医学方面研究。E-mail:WM8398@163.com。鹅副黏病毒(goose paramyxovirus,GPMV)是影响养禽业发展的主要病原之一,它可引起鹅肠道糠麸样溃疡、胰腺肿胀且表面有灰白色坏死灶、脾脏肿大并有大小不等的灰白色坏死灶。近年来,该病在我国呈上升趋势,且感染宿主范围不断扩大,已有鹅、丹顶鹤、鸽等感染该病毒的报道[1-3]。本研究对以前分离的GPMV的F基因进行克隆,并与国内外分离株进行序列比对和分析,以期为进一步研究该病毒的F基因功能和GPMV分子诊断以及基因工程疫苗奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

从疑似感染GPMV的病死鹅中分离到鹅副黏病毒HN株,经过冻干后,于海南省动物疫病预防控制中心兽医诊断检验科-70 ℃冻存。

1.2病毒增殖

将病毒适当稀释后,经尿囊腔接种9~11 d非免疫鸡胚,0.2 mL/枚,于37 ℃恒温箱孵育48 h,弃去24 h内死亡胚,无菌收获尿囊液,于-70 ℃保存备用。

1.3引物设计与合成

根据GenBank中的GPMV全基因组核苷酸序列,经 Lasergene 7.10软件比对和Primer 5.0软件分析后,设计1对引物扩增F基因,上游P1:5′-TAGTTCGCCTGTCTATCAAA-3′,下游P2:5′-GTGATGCGGTAGAACGGAT3-3′;由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

1.4RT-PCR反应

将含有GPMV的尿囊液按照Invitrogen公司提供的RNA抽提操作说明书进行RNA模板的提取。反转录按照宝生物工程(大连)有限公司提供的Reverse Transcriptase XL(AMV)反转录酶使用说明书进行。PCR反应体系为:2 μL模板,各50 pmol上、下游引物,各200 μmol/L 4种dNTP,0.5 μL Ex Taq DNA聚合酶,加水至50 μL。PCR反应条件为:97 ℃ 0.5 min,53 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,30个循环;72 ℃延伸 7 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.5F基因的克隆及鉴定

将新扩增PCR产物按一定比例与pMD18-T载体连接,连接产物转化入DH5α感受态细胞,阳性菌液经PCR鉴定后扩大培养并抽提质粒,重组质粒置于-40 ℃冰箱保存备用。

1.6序列分析

将鉴定的阳性重组质粒,送上海英潍捷基生物技术有限公司进行测序。用Lasergene 7.10软件将所测序列和与国内外病毒分离株的F基因序列进行相似性比对。

2结果与分析

2.1PCR扩增产物

利用设计的P1/P2引物对GPMV HN株的F基因进行RT-PCR扩增,结果获得大小约为2.1 kb的特异性条带,与预计产物大小相符(图1)。

2.2重组质粒的鉴定

菌液PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,获得大小约为2.1 kb的片段。

2.3序列分析

由序列测定结果可知,GPMV HN株的F基因全长为 1 662 bp,编码553个氨基酸。将GPMV HN株的F基因与国内外分离株的F基因序列进行比对,结果表明:GPMV HN株和国内已分离的GPMV的F蛋白核苷酸序列相似性在963%~97.3%之间,与传统疫苗株LaSota的核苷酸序列相似性为82.7%,与国外分离株的F蛋白核苷酸序列相似性在34.8%~38.7%之间(表1);从F基因进化树来看,GPMV HN株与国内分离株处于同一分支,而与国外分离株处于不同分支(图2)。

3结论与讨论

GPMV HN株的分离鉴定再次证明水禽不再仅是禽Ⅰ型副黏病毒的宿主,而且已成为禽Ⅰ型副黏病毒自然感染发病、死亡的易感禽类。这可能与禽Ⅰ型副黏病毒发生变异、逐渐适应鹅体有关[4]。宿主范围的不断扩大,给禽Ⅰ型副黏病毒的综合防控提出了新的挑战。

国内外研究表明,禽Ⅰ型副黏病毒F蛋白的变异主要发生于F蛋白N末端信号肽区(1~32aa)和裂解位点区(112~117aa),其他部位的氨基酸较保守,且裂解位点区氨基酸的组成是构成副黏病毒毒力的分子基础[5]。GPMV HN株的裂解位点区的氨基酸序列为112-Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe-117,与国外发表的强毒株序列112-Arg/Lys-Arg-Gln-Lys/Arg-Arg-Phe-117相符,表明所分离的GPMV HN株为强毒株。基因序列分析发现该分离株的F基因与GenBank登录号为AF162714株系的F基因核苷酸相似性为97.1%,氨基酸相似性为97.7%,二者的相似性较高。进化树分析表明两者处于同一分支,具有较近的亲缘关系,且同属于强毒株。GPMV HN株与传统疫苗株LaSota的核苷酸相似性为82.7%,氨基酸相似性为87.4%,二者的相似性较低,进化树上虽属于同一大分支,但亲缘关系相对较远,说明HN株与传统的疫苗株LaSota相比已发生一定的变异,这可能是造成水禽长期使用传统的新城疫病毒疫苗后仍暴发副黏病毒病的重要原因之一。

参考文献:

[1]秦卫红. 种鹅感染新城疫病毒的诊断[J]. 中国家禽,2012,34(23):55.

[2]李静姬,李福军,梁玉嬉. 丹顶鹤非典型新城疫与大肠杆菌混合感染的诊治[J]. 中国畜牧兽医,2013,40(2):211-213.

[3]赵扬,郭明萍,邹年莉,等. 两株鸽源新城疫病毒的分离鉴定及F基因序列分析[J]. 中国家禽,2012,34(23):10-13.

[4]张伟,刁有祥,徐福亮,等. 鹅副黏病毒LS-1株的分离鉴定及F基因分析[J]. 西南大学学报:自然科学版,2011,33(4):31-35.

[5]董国英,丁 壮. 鹅副黏病毒F基因的克隆及遗传变异分析[J]. 中国兽医学报,2007,27(2):176-179.

摘要:为了深入研究鹅副黏病毒(goose paramyxovirus,GPMV)F基因的功能,利用PCR方法克隆了鹅副黏病毒HN株的F基因,将其与pMD18-T载体连接后转化到感受态大肠杆菌DH5α中,经PCR鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析。结果表明:鹅副黏病毒HN株的F基因全长均为1 662 bp,编码553个氨基酸,其裂解位点的氨基酸序列为112-Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe-117,与已公布的强毒株裂解位点的氨基酸序列相符。

关键词:鹅副黏病毒;F基因;克隆;序列分析

中图分类号: Q785;S858.335.3 文献标志码: A 文章编号:1002-1302(2014)07-0035-02

收稿日期:2013-09-27

作者简介:吴民(1964—),男,海南海口人,兽医师,主要从事畜牧兽医学方面研究。E-mail:WM8398@163.com。鹅副黏病毒(goose paramyxovirus,GPMV)是影响养禽业发展的主要病原之一,它可引起鹅肠道糠麸样溃疡、胰腺肿胀且表面有灰白色坏死灶、脾脏肿大并有大小不等的灰白色坏死灶。近年来,该病在我国呈上升趋势,且感染宿主范围不断扩大,已有鹅、丹顶鹤、鸽等感染该病毒的报道[1-3]。本研究对以前分离的GPMV的F基因进行克隆,并与国内外分离株进行序列比对和分析,以期为进一步研究该病毒的F基因功能和GPMV分子诊断以及基因工程疫苗奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

从疑似感染GPMV的病死鹅中分离到鹅副黏病毒HN株,经过冻干后,于海南省动物疫病预防控制中心兽医诊断检验科-70 ℃冻存。

1.2病毒增殖

将病毒适当稀释后,经尿囊腔接种9~11 d非免疫鸡胚,0.2 mL/枚,于37 ℃恒温箱孵育48 h,弃去24 h内死亡胚,无菌收获尿囊液,于-70 ℃保存备用。

1.3引物设计与合成

根据GenBank中的GPMV全基因组核苷酸序列,经 Lasergene 7.10软件比对和Primer 5.0软件分析后,设计1对引物扩增F基因,上游P1:5′-TAGTTCGCCTGTCTATCAAA-3′,下游P2:5′-GTGATGCGGTAGAACGGAT3-3′;由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

1.4RT-PCR反应

将含有GPMV的尿囊液按照Invitrogen公司提供的RNA抽提操作说明书进行RNA模板的提取。反转录按照宝生物工程(大连)有限公司提供的Reverse Transcriptase XL(AMV)反转录酶使用说明书进行。PCR反应体系为:2 μL模板,各50 pmol上、下游引物,各200 μmol/L 4种dNTP,0.5 μL Ex Taq DNA聚合酶,加水至50 μL。PCR反应条件为:97 ℃ 0.5 min,53 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,30个循环;72 ℃延伸 7 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.5F基因的克隆及鉴定

将新扩增PCR产物按一定比例与pMD18-T载体连接,连接产物转化入DH5α感受态细胞,阳性菌液经PCR鉴定后扩大培养并抽提质粒,重组质粒置于-40 ℃冰箱保存备用。

1.6序列分析

将鉴定的阳性重组质粒,送上海英潍捷基生物技术有限公司进行测序。用Lasergene 7.10软件将所测序列和与国内外病毒分离株的F基因序列进行相似性比对。

2结果与分析

2.1PCR扩增产物

利用设计的P1/P2引物对GPMV HN株的F基因进行RT-PCR扩增,结果获得大小约为2.1 kb的特异性条带,与预计产物大小相符(图1)。

2.2重组质粒的鉴定

菌液PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,获得大小约为2.1 kb的片段。

2.3序列分析

由序列测定结果可知,GPMV HN株的F基因全长为 1 662 bp,编码553个氨基酸。将GPMV HN株的F基因与国内外分离株的F基因序列进行比对,结果表明:GPMV HN株和国内已分离的GPMV的F蛋白核苷酸序列相似性在963%~97.3%之间,与传统疫苗株LaSota的核苷酸序列相似性为82.7%,与国外分离株的F蛋白核苷酸序列相似性在34.8%~38.7%之间(表1);从F基因进化树来看,GPMV HN株与国内分离株处于同一分支,而与国外分离株处于不同分支(图2)。

3结论与讨论

GPMV HN株的分离鉴定再次证明水禽不再仅是禽Ⅰ型副黏病毒的宿主,而且已成为禽Ⅰ型副黏病毒自然感染发病、死亡的易感禽类。这可能与禽Ⅰ型副黏病毒发生变异、逐渐适应鹅体有关[4]。宿主范围的不断扩大,给禽Ⅰ型副黏病毒的综合防控提出了新的挑战。

国内外研究表明,禽Ⅰ型副黏病毒F蛋白的变异主要发生于F蛋白N末端信号肽区(1~32aa)和裂解位点区(112~117aa),其他部位的氨基酸较保守,且裂解位点区氨基酸的组成是构成副黏病毒毒力的分子基础[5]。GPMV HN株的裂解位点区的氨基酸序列为112-Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe-117,与国外发表的强毒株序列112-Arg/Lys-Arg-Gln-Lys/Arg-Arg-Phe-117相符,表明所分离的GPMV HN株为强毒株。基因序列分析发现该分离株的F基因与GenBank登录号为AF162714株系的F基因核苷酸相似性为97.1%,氨基酸相似性为97.7%,二者的相似性较高。进化树分析表明两者处于同一分支,具有较近的亲缘关系,且同属于强毒株。GPMV HN株与传统疫苗株LaSota的核苷酸相似性为82.7%,氨基酸相似性为87.4%,二者的相似性较低,进化树上虽属于同一大分支,但亲缘关系相对较远,说明HN株与传统的疫苗株LaSota相比已发生一定的变异,这可能是造成水禽长期使用传统的新城疫病毒疫苗后仍暴发副黏病毒病的重要原因之一。

参考文献:

[1]秦卫红. 种鹅感染新城疫病毒的诊断[J]. 中国家禽,2012,34(23):55.

[2]李静姬,李福军,梁玉嬉. 丹顶鹤非典型新城疫与大肠杆菌混合感染的诊治[J]. 中国畜牧兽医,2013,40(2):211-213.

[3]赵扬,郭明萍,邹年莉,等. 两株鸽源新城疫病毒的分离鉴定及F基因序列分析[J]. 中国家禽,2012,34(23):10-13.

[4]张伟,刁有祥,徐福亮,等. 鹅副黏病毒LS-1株的分离鉴定及F基因分析[J]. 西南大学学报:自然科学版,2011,33(4):31-35.

[5]董国英,丁 壮. 鹅副黏病毒F基因的克隆及遗传变异分析[J]. 中国兽医学报,2007,27(2):176-179.

摘要:为了深入研究鹅副黏病毒(goose paramyxovirus,GPMV)F基因的功能,利用PCR方法克隆了鹅副黏病毒HN株的F基因,将其与pMD18-T载体连接后转化到感受态大肠杆菌DH5α中,经PCR鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析。结果表明:鹅副黏病毒HN株的F基因全长均为1 662 bp,编码553个氨基酸,其裂解位点的氨基酸序列为112-Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe-117,与已公布的强毒株裂解位点的氨基酸序列相符。

关键词:鹅副黏病毒;F基因;克隆;序列分析

中图分类号: Q785;S858.335.3 文献标志码: A 文章编号:1002-1302(2014)07-0035-02

收稿日期:2013-09-27

作者简介:吴民(1964—),男,海南海口人,兽医师,主要从事畜牧兽医学方面研究。E-mail:WM8398@163.com。鹅副黏病毒(goose paramyxovirus,GPMV)是影响养禽业发展的主要病原之一,它可引起鹅肠道糠麸样溃疡、胰腺肿胀且表面有灰白色坏死灶、脾脏肿大并有大小不等的灰白色坏死灶。近年来,该病在我国呈上升趋势,且感染宿主范围不断扩大,已有鹅、丹顶鹤、鸽等感染该病毒的报道[1-3]。本研究对以前分离的GPMV的F基因进行克隆,并与国内外分离株进行序列比对和分析,以期为进一步研究该病毒的F基因功能和GPMV分子诊断以及基因工程疫苗奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

从疑似感染GPMV的病死鹅中分离到鹅副黏病毒HN株,经过冻干后,于海南省动物疫病预防控制中心兽医诊断检验科-70 ℃冻存。

1.2病毒增殖

将病毒适当稀释后,经尿囊腔接种9~11 d非免疫鸡胚,0.2 mL/枚,于37 ℃恒温箱孵育48 h,弃去24 h内死亡胚,无菌收获尿囊液,于-70 ℃保存备用。

1.3引物设计与合成

根据GenBank中的GPMV全基因组核苷酸序列,经 Lasergene 7.10软件比对和Primer 5.0软件分析后,设计1对引物扩增F基因,上游P1:5′-TAGTTCGCCTGTCTATCAAA-3′,下游P2:5′-GTGATGCGGTAGAACGGAT3-3′;由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

1.4RT-PCR反应

将含有GPMV的尿囊液按照Invitrogen公司提供的RNA抽提操作说明书进行RNA模板的提取。反转录按照宝生物工程(大连)有限公司提供的Reverse Transcriptase XL(AMV)反转录酶使用说明书进行。PCR反应体系为:2 μL模板,各50 pmol上、下游引物,各200 μmol/L 4种dNTP,0.5 μL Ex Taq DNA聚合酶,加水至50 μL。PCR反应条件为:97 ℃ 0.5 min,53 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,30个循环;72 ℃延伸 7 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.5F基因的克隆及鉴定

将新扩增PCR产物按一定比例与pMD18-T载体连接,连接产物转化入DH5α感受态细胞,阳性菌液经PCR鉴定后扩大培养并抽提质粒,重组质粒置于-40 ℃冰箱保存备用。

1.6序列分析

将鉴定的阳性重组质粒,送上海英潍捷基生物技术有限公司进行测序。用Lasergene 7.10软件将所测序列和与国内外病毒分离株的F基因序列进行相似性比对。

2结果与分析

2.1PCR扩增产物

利用设计的P1/P2引物对GPMV HN株的F基因进行RT-PCR扩增,结果获得大小约为2.1 kb的特异性条带,与预计产物大小相符(图1)。

2.2重组质粒的鉴定

菌液PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,获得大小约为2.1 kb的片段。

2.3序列分析

由序列测定结果可知,GPMV HN株的F基因全长为 1 662 bp,编码553个氨基酸。将GPMV HN株的F基因与国内外分离株的F基因序列进行比对,结果表明:GPMV HN株和国内已分离的GPMV的F蛋白核苷酸序列相似性在963%~97.3%之间,与传统疫苗株LaSota的核苷酸序列相似性为82.7%,与国外分离株的F蛋白核苷酸序列相似性在34.8%~38.7%之间(表1);从F基因进化树来看,GPMV HN株与国内分离株处于同一分支,而与国外分离株处于不同分支(图2)。

3结论与讨论

GPMV HN株的分离鉴定再次证明水禽不再仅是禽Ⅰ型副黏病毒的宿主,而且已成为禽Ⅰ型副黏病毒自然感染发病、死亡的易感禽类。这可能与禽Ⅰ型副黏病毒发生变异、逐渐适应鹅体有关[4]。宿主范围的不断扩大,给禽Ⅰ型副黏病毒的综合防控提出了新的挑战。

国内外研究表明,禽Ⅰ型副黏病毒F蛋白的变异主要发生于F蛋白N末端信号肽区(1~32aa)和裂解位点区(112~117aa),其他部位的氨基酸较保守,且裂解位点区氨基酸的组成是构成副黏病毒毒力的分子基础[5]。GPMV HN株的裂解位点区的氨基酸序列为112-Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe-117,与国外发表的强毒株序列112-Arg/Lys-Arg-Gln-Lys/Arg-Arg-Phe-117相符,表明所分离的GPMV HN株为强毒株。基因序列分析发现该分离株的F基因与GenBank登录号为AF162714株系的F基因核苷酸相似性为97.1%,氨基酸相似性为97.7%,二者的相似性较高。进化树分析表明两者处于同一分支,具有较近的亲缘关系,且同属于强毒株。GPMV HN株与传统疫苗株LaSota的核苷酸相似性为82.7%,氨基酸相似性为87.4%,二者的相似性较低,进化树上虽属于同一大分支,但亲缘关系相对较远,说明HN株与传统的疫苗株LaSota相比已发生一定的变异,这可能是造成水禽长期使用传统的新城疫病毒疫苗后仍暴发副黏病毒病的重要原因之一。

参考文献:

[1]秦卫红. 种鹅感染新城疫病毒的诊断[J]. 中国家禽,2012,34(23):55.

[2]李静姬,李福军,梁玉嬉. 丹顶鹤非典型新城疫与大肠杆菌混合感染的诊治[J]. 中国畜牧兽医,2013,40(2):211-213.

[3]赵扬,郭明萍,邹年莉,等. 两株鸽源新城疫病毒的分离鉴定及F基因序列分析[J]. 中国家禽,2012,34(23):10-13.

[4]张伟,刁有祥,徐福亮,等. 鹅副黏病毒LS-1株的分离鉴定及F基因分析[J]. 西南大学学报:自然科学版,2011,33(4):31-35.

[5]董国英,丁 壮. 鹅副黏病毒F基因的克隆及遗传变异分析[J]. 中国兽医学报,2007,27(2):176-179.

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