金纳米粒子表面能量转移法测定水中的铅离子

刘春等

摘要荧光素修饰的凝血酶适配体（5′FAMGGT TGG TGT GGT TGG3′）可与Pb2+选择性地形成G四链体，这一构象变化能改变作为能量供体的荧光染料和作为能量受体的金纳米粒子之间的距离，使体系的荧光强度与Pb2+浓度具有一定的相关性，从而建立了一种基于纳米材料表面能量转移灵敏检测水溶液中Pb2+的分析方法。研究表明，在Pb2+浓度为12.5～100 nmol/L范围内，荧光恢复效率（F/F0）与Pb2+浓度间呈良好的线性关系，线性回归方程为y=0.910+0.007c（R2=0.997），检出限为10 nmol/L。用本方法检测自来水中Pb2+，结果令人满意。

1引言

纳米材料表面能量转移（Nanomaterials surface energy transfer，NSET）在分析化学及生物药物分析等领域被广泛应用，如示踪DNA或蛋白质分子的构象改变，识别DNA折叠的中间产物，监测DNA与金属离子的相互作用以及测定与疾病相关的重要生物分子＼[1～4＼]。在本质上，NSET是偶极偶极相互作用，它与荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）的不同之处在于NSET的能量受体是纳米粒子表面，其通过在几何学上各向同性的偶极向量分布接受供体的能量。NSET增大了供受体之间的能量转移效率，相比FRET，它具有两个重要特点＼[5，6＼]：同一个纳米粒子能猝灭从可见到近红外发射波长的荧光；能量转移效率与距离的关系从1/R6变成1/R4，使得NSET的有效作用距离（约15 nm）比FRET（9 nm）增大了约2倍＼[6＼]。

铅污染是一种分布广泛的重金属污染，它能导致人体肾脏损伤和智力发育迟滞＼[7＼]。因此，发展简单灵敏的实时监测环境中Pb2+污染的方法意义重大。目前，基于脱氧核酶的铅离子传感器由于其高灵敏度和高选择性被广泛地用于测定水中Pb2+ ＼[8～14＼]。例如Lu等利用脱氧核酶建立了一系列比色法＼[10～12＼]和荧光共振能量转移法＼[13＼]用于测定Pb2+。Pb2+脱氧核酶是由一个酶及底物链构成，当Pb2+存在时，脱氧核酶可以催化底物链发生特异性的水解断裂。这一特性常被用来控制纳米粒子聚集和荧光共振能量转移供受体之间的距离。在这些方法中，灵敏度和选择性都较好，但是由于所用脱氧核酶发生特异性水解断裂的过程需要严格的反应条件，使得操作过程比较复杂。

研究发现，Pb2+由于具有与G四链体结构空腔尺寸适合的离子半径（r =0.129 nm）以及与碱基的强配位作用，能与富含G碱基的寡聚核苷酸链形成稳定的G四链体结构＼[15＼]。近来有研究报道，凝血酶适配体（Thrombinbinding aptamer，TBA，5′GGT TGG TGT GGT TGG3′） 就可以选择性地与Pb2+形成G四链体＼[16＼]。本研究中在TBA DNA的5′端修饰上荧光染料FAM作为能量供体，利用柠檬酸根稳定的球形金纳米粒子作为能量受体，通过表面能量转移建立了测定水溶液中Pb2+的分析方法。在Pb2+诱导下，该DNA链从自由缠绕状态转变成G四链体。由于单链DNA和G四链体的DNA（或双链DNA）具有不同的静电特性，对金纳米粒子具有不同的吸附能力＼[17＼]。因此，与Pb2+浓度相关的DNA折叠过程会改变金纳米粒子与染料分子之间的距离，从而影响两者之间的能量转移效率，具体体现在染料荧光强度的变化。本方法通过监测体系的荧光强度变化就可以简单灵敏地实现对Pb2+的定量检测。

2实验部分

2.1仪器与试剂

Hitachi F2500型荧光分光光度计（日本日立公司），以485 nm激发，500～600 nm 之间扫描荧光发射光谱。Shimadzu UV3600 型紫外可见近红外分光光度计（日本岛津公司）；PHS3C 型酸度计（成都世纪方舟科技开发公司）； QL901型漩涡混合器（江苏其林贝尔仪器制造有限公司）； 901型恒温磁力搅拌器（上海精科实业有限公司）。

HAuCl4·4H2O（上海国药集团化学试剂有限公司）；柠檬酸三钠（上海化学试剂公司）；Pb（NO3）2（重庆川东化工试剂公司）；荧光素修饰的单链DNA（5′FAMGGT TGG TGT GGT TGG3′，上海生工生物工程技术与服务有限公司合成）。将DNA干粉以5000 r/min离心5 min后，加入1 mL新煮沸并冷却的超纯水混匀，4 ℃下保存待用。实验用水均为超纯水（重庆利迪现代水技术设备有限公司LD50GE型超纯水机制备，18.2 MΩ cm）。实验中使用三羟甲基氨基甲烷乙酸（TrisHAc）缓冲溶液控制溶液酸度。试剂均为分析纯。

2.2实验方法

2.2.1金纳米粒子（AuNPs）的合成根据文献＼[18＼] 的方法稍作修改合成了柠檬酸根稳定的AuNPs。具体步骤为：在100 mL 平底烧瓶中依次加入49 mL 超纯水，1 mL 1% HAuCl4，磁力搅拌下加热至沸腾；剧烈搅拌下迅速加入1 mL 5% 柠檬酸三钠，溶液的颜色变为浅黄色；继续磁力搅拌并使溶液保持沸腾，5 min内可观察到溶液的颜色从浅黄色经由蓝黑色，最终转变为鲜红色；停止加热，继续搅拌直至溶液冷却至室温。测得该溶液的LSPR峰最大吸收波长在520 nm处。其浓度依照LSPR消光光谱和朗伯

3结果与讨论

3.1NSET传感法检测铅离子的原理

因而与AuNPs之间具有强烈的亲和力，使得TBA很容易被吸附到金纳米粒子表面＼[17＼]。通过TBA在金纳米粒子表面的吸附，修饰于TBA上的FAM染料分子可以靠近金纳米粒子，发生从FAM到金纳米粒子表面的能量转移，使得FAM染料的荧光被猝灭。当加入Pb2+后，TBA由于含有9个G碱基，它们能与Pb2+特异性结合，使TBA从自由缠绕结构转变为G四链体。由于G四链体中暴露在外的是带负电荷的磷酸盐骨架，它们与带负电荷的金纳米粒子之间能产生强烈的静电排斥力＼[17＼]，显著增加了TBA上携带的染料分子与金纳米粒子之间的距离，减弱了染料分子与金纳米粒子之间的表面能量转移，体系的荧光信号得到恢复。在一定范围内，形成四链体的程度与Pb2+加入浓度成正比，使得体系的荧光强度也与Pb2+浓度成正比，据此建立了基于表面能量转移的分析方法用于定量测定水中的Pb2+的方法。

为了示踪Pb2+引起的TBA构象改变以及与AuNPs之间的表面能量转移，利用普通的荧光分光光度计分别测定Pb2+存在与否情况下修饰于TBA链上的FAM的荧光强度（图2）。从图2可见，在没有AuNPs和Pb2+存在情况下，FAMTBA在520 nm处展示出很强的荧光发射（图2a）；当加入AuNPs后，由于AuNPs与FAM之间有效的表面能量转移，FAMTBA的荧光几乎被完全猝灭（图2c）。这一现象与文献＼[21＼]所观察到的金纳米粒子对荧光团有较高猝灭效率是一致的。而当Pb2+和AuNPs均被加入体系中时，由于Pb2+诱导FAMTBA的构象发生改变，使得FAM与AuNPs的距离大大增加，降低了表面能量转移的效率，从而使荧光得到一定程度的恢复（图2b），据此实现对Pb2+的检测。

3.2其它金属离子的响应3.3线性范围及实际应用

在最优实验条件下，利用TBA探针基于表面能量转移选择性测定Pb2+。在Pb2+浓度为12.5～100 nmol/L范围内，获得了荧光恢复效率（F/F0）与Pb2+浓度间的线性关系，线性回归方程为y=0.910+0.007c （y为体系的荧光恢复效率F/F0，c为Pb2+浓度（nmol/L）， R2=0.997，图4），检出限（3σ）为10 nmol/L。 依据美国环境保护署（EPA）规定的饮用水中Pb2+浓度不得高于0.015 mg/L （折合72 nmol/L）的标准＼[13＼]，本方法对Pb2+的线性响应范围正好可用于监测饮用水中Pb2+的含量。采用标准样品加入法，对自来水中Pb2+进行定量检测。为避免次氯酸盐的强氧化性对实验的干扰，在分析之前，自来水需先煮沸。实验结果见表1，标准加入回收率结果令人满意。

4结论

通过Pb2+诱导FAMTBA形成G四链体，并基于FAM与AuNPs之间的表面能量转移，建立了一种简单、快速、灵敏的Pb2+传感方法。在最佳实验条件下，其检测线性范围为12.5～100 nmol/L，检出限（3σ）为10 nmol/L。美国环境保护署（EPA）规定饮用水中Pb2+浓度不得高于0.015 mg/L （折合72 nmol/L），故本方法可用于监测自来水中的Pb2+。

4LIU Chun， WU Tong， HUANG ChengZhi. Sci. China Ser. B， 2010， 40（5）： 531-537

刘 春， 吴 同， 黄承志. 中国科学B： 化学， 2010， 40（5）： 531-537

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20Li T， Wang E， Dong S. Anal. Chem.， 2010， 82（4）： 1515-1520

21Jennings T L， Schlatterer J C， Singh M P， Greenbaum N L， Strouse G F. Nano Lett.， 2006， 6（7）： 1318-1324

22Nagatoishi S， Nojima T， Galezowska E， Juskowiak B， Takenaka S. ChemBioChem.， 2006， 7： 1730-1737

23Nagatoishi S， Nojima T， Juskowiak B， Takenaka S. Angew. Chem. Int. Ed.， 2005， 44： 5067-5070

AbstractWe established a sensitive method for the detection of lead ions in aqueous solution based on the surface energy transfer between gold nanoparticles and fluorescent dyes. The fluoresceinmodified thrombin aptamer （5′FAMGGT TGG TGT GGT TGG3′） can be selectively transformed to Gquadruplex induced by lead ions. The conformation changes of the aptamer can alter the distance between the energy donor of fluorescent dyes and the energy receptor of gold nanoparticles， and further enhance the fluorescence intensity. The fluorescence recovery efficiency （F/F0） is proportional to the concentration of lead ions in the range of 12.5-100 nmol/L following the linear regression equation of y=0.910+0.007c（R2=0.997）and the limit of determination is about 10 nmol/L. The proposed method has been applied to the determination of lead ions in tap water with satisfied results.

KeywordsAptamer； Gquadruplex； Gold nanoparticles； Surface energy transfer； Lead ions

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AbstractWe established a sensitive method for the detection of lead ions in aqueous solution based on the surface energy transfer between gold nanoparticles and fluorescent dyes. The fluoresceinmodified thrombin aptamer （5′FAMGGT TGG TGT GGT TGG3′） can be selectively transformed to Gquadruplex induced by lead ions. The conformation changes of the aptamer can alter the distance between the energy donor of fluorescent dyes and the energy receptor of gold nanoparticles， and further enhance the fluorescence intensity. The fluorescence recovery efficiency （F/F0） is proportional to the concentration of lead ions in the range of 12.5-100 nmol/L following the linear regression equation of y=0.910+0.007c（R2=0.997）and the limit of determination is about 10 nmol/L. The proposed method has been applied to the determination of lead ions in tap water with satisfied results.

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AbstractWe established a sensitive method for the detection of lead ions in aqueous solution based on the surface energy transfer between gold nanoparticles and fluorescent dyes. The fluoresceinmodified thrombin aptamer （5′FAMGGT TGG TGT GGT TGG3′） can be selectively transformed to Gquadruplex induced by lead ions. The conformation changes of the aptamer can alter the distance between the energy donor of fluorescent dyes and the energy receptor of gold nanoparticles， and further enhance the fluorescence intensity. The fluorescence recovery efficiency （F/F0） is proportional to the concentration of lead ions in the range of 12.5-100 nmol/L following the linear regression equation of y=0.910+0.007c（R2=0.997）and the limit of determination is about 10 nmol/L. The proposed method has been applied to the determination of lead ions in tap water with satisfied results.

KeywordsAptamer； Gquadruplex； Gold nanoparticles； Surface energy transfer； Lead ions