阿维菌素高产菌株的诱变筛选及生产工艺的优化

杨洋

摘要：阿维菌素是具有杀虫、杀螨、杀线虫的酯类化合物，广泛应用于现代农作物，本文通过运用紫外线、亚硝基胍诱变的方式对阿维菌素的出发菌株SDSLAV-1进行了诱变，筛选除了阿维菌素的高产菌株SDSLAV-02-01，其比出发菌株要高47%。

关键词：阿维菌素 诱变筛选 工艺

阿维菌素具有安全、高效的农药特性，在常规用量下对人畜不会构成伤害，因此阿维菌素具有广泛的应用空间，由于阿维菌素生产企业之间的竞争加速，要求阿维菌素生产企业要降低生产成本，提高阿维菌素发酵单位与成品收率、优化生产工艺。

1 阿维菌素诱变筛选的材料与方法

1.1 材料

1.1.1 出发菌株。阿维链霉菌由山东胜利生物工程有限公司提供，出发菌株经过诱变之后得到SDSLAV-01、SDSLAV-02。

1.1.2 主要试剂。本实验采取的化学原料主要包括：玉米淀粉、高温黄豆饼粉、花生饼粉、亚硝基胍、淀粉酶等。

1.1.3 主要仪器。实验中涉及到的仪器包括：PH机、超净工作台、摇床、显微镜、发酵罐、种子罐、结晶罐等。

1.1.4 培养基。培养基主要包括：一级种子罐培养基、二级种子罐培养基、发酵罐培养基，不同的培养基具有不同的配方。

1.2 诱变方法

1.2.1 紫外线诱变。首先取5ml配制好的阿维菌悬液放入直径90mm的无菌培养罐中，并利用无菌的磁力棒进行搅拌，然后放在功率为20W的紫外线下，打开无菌培养罐，进行边照射边搅拌，然后按照不同的时间段，提出相同的阿维菌素液进行不同程度的稀释，最后放置在分离平板上，进行7～9d的培养。

1.2.2 亚硝基胍诱变。使用浓度为108个/ml的磷酸缓冲液制备孢子悬液，分别用不同浓度的NTG处理紫外线诱变后的突变株单孢子悬液，在适当的温度环境下震动30秒后，利用生理盐清洗3遍后，至于分离平板，倒置培养7d。

2 結果与讨论

2.1 紫外线筛选。经过紫外线诱变培养之后，计算紫外线诱变的孢子死亡率，得出以下数据（见表1）。

通过表1可以清楚的获悉袍子经过90秒的紫外线筛选后，其死亡率达到了100%，随机选择单菌，经过培养后在摇瓶中进行发酵，之后利用相关仪器测量发酵效价，经过反复筛选，获得一支较为稳定的突变株SDSLAV-02，其比出发菌株的产量要高34%。笔者将此作为下一步的诱变实验对象。

2.2 亚硝基胍诱变筛选。通过对亚硝基胍诱变筛选的计算得出相关数据（见表2）。

表2 亚硝基胍诱变结果

由表2可见：在磷酸缓冲剂pH6.0环境下，NTG浓度在1mg/ml时死亡率最低，为4mg/ml时，其死亡率最高。同样笔者随机选取10个单菌培养后进行发酵，然后测定菌株B1a组分效价，并且获得各个浓度诱变滞后的正向突变率（见表3）。

表3 NTG诱变结果

同理，当亚硝基胍浓度为1时其诱变效果最佳，其正向突变率达到了15，因此用低浓度的亚硝基胍诱变进行菌株可以获得SDSLAV-02-01。

3 阿维菌素发酵工艺的优化

3.1 阿维菌素发酵培养基的优化。阿维菌素发酵不仅需要优质的高产菌株，还要有良好的培养基，因为阿维菌素的发酵需要培养基给予提供必要的营养，不同的培养基对阿维菌素的发酵会产生不同的效果。

3.1.1 碳源的优化。为验证不同碳源对阿维菌素的发酵的影响，笔者采取不同的碳源作为培养基实验对象，根据实验获悉，在相同条件下，玉米淀粉作为阿维菌素发酵培养基的发酵单位最高，而且玉米淀粉的价格、储存等各方面也比较合适，有利于企业节省生产成本，因此碳源的优化来源为14%的玉米淀粉。

3.1.2 氮源的优化。根据实验获悉，高温黄豆饼粉饰阿维菌素发酵生产水平最高的氮源，虽然高温黄豆饼粉的单位含氮量不高，但是其发酵水平要高于其他氮源物质，因此选择高温黄豆饼粉作为阿维菌素氮源。

3.2 阿维菌素发酵工艺控制的优化

3.2.1 阿维菌素种子罐的指标控制。阿维菌素种子罐分为一级种子罐和二级种子罐，一级种子罐的控制指标是溶氧控制在20%，温度为28℃，时间为30h；二级种子罐的指标控制为接种量控制在10%，培养时间为20h。

3.2.2 发酵过程溶氧的控制。溶氧控制对发酵液的影响非常大，因为在发酵前，培养基的营养比较丰富，菌体的生长速度非常得快，而随着发酵时间的推进，菌体消耗氧量就会增加，其溶氧就会下降，溶氧过低就会影响菌体的生长。对此可以采取以下措施控制阿维菌素发酵溶氧问题：一是通过控制发酵罐的搅拌转速控制溶氧。随着培养时间的推移，菌体的新陈代谢速度就会上升，菌丝的密度就会增加，其溶氧的密度就会越来越小，而通过控制转速可以有效地解决溶氧问题；二是调整通气量。增加发酵罐的通气量是增强阿维菌素发酵液的含气率，有利于氧气的传递。

参考文献：

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