园林废弃物堆肥中木质素降解菌的鉴定及其降解能力研究

陈 莹， 张俊涛， 阮 琳

(广州市园林科学研究所，广东 广州 510405)

园林废弃物堆肥中木质素降解菌的鉴定及其降解能力研究

陈 莹， 张俊涛， 阮 琳

(广州市园林科学研究所，广东 广州 510405)

【目的】筛选出具有木质素降解功能的菌株，用于园林废弃物降解.【方法】通过对从园林废弃物高温好氧发酵堆体中筛选得到的菌株进行分子生物学鉴定，得出目标菌，并将该菌接种在灭菌的小叶榕枝条上，测定小叶榕枝条的木质素、纤维素和半纤维素含量.【结果和结论】结果表明，目标菌为一株链霉菌Streptomycessp.；在小叶榕碎枝条上接种不同用量(5%、10%、15%)的该菌一级发酵液，培养45 d后，与对照相比，木质素质量分数可降低22.48%，半纤维素质量分数可降低26.60%.

园林废弃物； 堆肥； 木质素降解菌； DNA鉴定

近年来，全国各地城市绿化发展迅速，2012年，我国城市建成区绿化覆盖率达39.2%，绿地率达35.3%[1]，而且呈逐年增加的趋势.但随之也产生了大量的园林废弃物，包括枯枝落叶、乔木灌木修剪物、草坪修剪物、残花等.利用传统的焚烧和填埋处理手段处理此类有机质含量高、营养元素齐全、污染成分少的废弃物资源，不仅会造成气体或水体污染，也会造成资源浪费，不符合循环经济和建设节约型社会的思路[2-5].堆肥资源化是利用物理、化学及生物技术，通过高温好氧发酵降解园林废弃物进而生产土壤改良剂、营养基质、有机肥等产品，实现园林废弃物在城市绿化生态系统内的循环利用，并具有广阔应用前景的处置方式[6-8].然而，园林废弃物尤其是木本植物残体的结构复杂，木质素包围着纤维素，两者结合形成极难降解的“木质纤维素”，难以被大多数微生物直接作为能源物质转化，严重限制了园林废弃物降解的效率[9-10].因此，破坏木质纤维素结构是加快园林废弃物降解、提高其资源化利用的前提条件，目前的方法主要包括物理法、化学法和生物法[11-12]，其中，生物法以其降解率高、能耗低、环保等优点而备受推崇.

自然界参与降解木质素的微生物有真菌、放线菌和细菌.目前，国际上以真菌的研究居多，如白腐真菌[13-16].我国在木质素降解微生物方面的研究起步较晚, 具有较强木质素降解能力的菌种匮乏，而且目前研究最多的木质素降解菌，如白腐菌中的黄孢原毛平革菌Phanerochaetechrysosporium等，是低温木质素降解菌，环境的改变会影响其木质素降解率[10]，因此，筛选适于园林废弃物堆肥的微生物菌株具有重要意义.本研究从园林废弃物高温好氧发酵堆体中分离出菌株并进行分子生物学鉴定，得到对木质素具有降解能力的菌株，为培育适于园林废弃物高温好氧堆肥的木质素降解菌提供科学依据，也为提高园林废弃物堆肥资源化效率提供一条可行的途径.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株 由广州市绿风生物技术有限公司园林废弃物高温好氧发酵堆体中筛选得到.

1.1.2 培养基 LB培养基：酵母浸出物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，氯化钠10.0 g，琼脂18～20 g，蒸馏水1 000 mL.

高氏一号培养基：可溶性淀粉20 g，氯化钠0.5 g，硝酸钾1.0 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂18～20 g，蒸馏水1 000 mL.

虎红培养基：胰蛋白胨5.0 g，磷酸二氢钾1.0 g，硫酸镁0.5 g，葡萄糖10.0 g，孟加拉红(虎红)0.033 g，氯霉素0.1 g，琼脂18～20 g，蒸馏水1 000 mL.

1.1.3 小叶榕碎枝条 取自广州市绿风生物技术有限公司，粒径≤3 cm，含水量42.32%.

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的采集、分离、纯化 于园林废弃物高温好氧发酵堆体5个不同点位取堆肥样品，并将其混匀.称取样品10.0 g，根据逐级稀释法[17]得1×10-1～1×10-7系列稀释度的菌悬液.根据LB培养基、高氏一号培养基和虎红培养基配方依次配制成细菌培养基(简称LB)、放线菌培养基(简称G)和真菌培养基(简称H).将1×10-4～1×10-6稀释度的菌悬液涂平板于LB培养基表面，每种稀释度重复3次；将1×10-3～1×10-5稀释度的菌悬液涂平板于G培养基表面，每种稀释度重复3次；将1×10-1～1×10-3稀释度的菌悬液涂平板于H培养基表面，每种稀释度重复3次；每种培养基以涂无菌水为对照(CK)，各重复3次.将1×10-6稀释度的LB培养基、1×10-5稀释度的G培养基和1×10-3稀释度的H培养基上生长的菌，根据外观形态用划线法进行分离、纯化(培养温度为50 ℃).

1.2.2 菌株的鉴定 将分离纯化得到的11株菌株(编号分别为H1、H2、G1、G2、LB1～LB7)，经过DNA序列分析结果进行鉴定.基因组DNA的提取参考江晓等[18]的方法.菌株LB1～LB5的DNA采用细菌的16S rRNA通用引物PCR扩增细菌16S rDNA，其引物序列为：27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)；1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′).菌株H1、H2、G1、G2 、LB6和LB7的DNA采用真菌的ITS通用引物PCR扩增真菌，其引物序列为：27F(ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC)；ITS5:GGAAGTAAAAGT-CGTAACAAGG).DNA序列测定由上海英骏生物技术有限公司进行.

1.2.3 木质素降解能力测定 在无菌条件下，用接种环轻挑成熟的木质素降解菌，将其接入装有高氏一号培养液的三角瓶中，置旋转式摇床(30 ℃，160 r/min)，培养5～7 d，即得一级发酵液.

称取10.00 g的小叶榕碎枝条于培养皿中，在160 ℃的烘箱内灭菌2.5 h.在无菌条件下，向装有小叶榕碎枝条的培养皿中分别加入5 mL无菌水润湿，放置过夜.本试验设置4个处理，其中：T1、T2、T3处理分别为接种木质素降解菌一级发酵液5 mL(接菌量为5%)、10 mL(接菌量为10%)，和15 mL(接菌量为15%)，以添加灭菌的高氏一号营养液10 mL为对照(CK)，每个处理重复3次.于30 ℃的培养箱中培养，45 d后，取样进行纤维素、半纤维素和木质素含量测定[19].

1.3 数据处理

试验数据用SAS软件进行分析.

2 结果与分析

2.1 菌株的采集、分离和纯化

经过菌种的采集、分离和纯化，从园林废弃物高温好氧发酵堆体中筛选得到8株菌株，编号分别为H1、LB1～LB7.

2.2 菌株的序列测定

菌株LB1～LB5的DNA采用16S rRNA通用引物PCR扩增；菌株H1、LB6和LB7的DNA采用真菌的ITS通用引物PCR扩增，分别进行DNA电泳测序，扩增片段进行纯化， DNA片段大小见表1；16S rDNA电泳图和PCR扩增电泳图以菌株LB4为例(图1)；PCR产物经过上海英骏生物技术有限公司测序，分别将各菌种的测序结果在国际互联网(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)基因库(Gene bank)上用BLAST对菌株序列进行搜索，其中菌株LB3相似性为93%，不足以鉴定到属名，为未知名菌；菌株LB7与编号AM930339.1和JF227580.1的菌株相似度最高，相似性为99%，但这两株菌株均未知属名，故菌株LB7也为未知名菌；其余菌株比对结果详见表1.

表1 基因库中序列比对结果Tab.1 The DNA sequence alignment from GenBank

M1： -Hind Ш digests；M 、M2：DNA marker DL2000.

Fig.1 16S rDNA electrophoragram (a), the electrophoresis results of PCR segment(b) and the electrophoresis of the cloned fragment(c) on strain LB4

通过DNA序列比对，各菌株的鉴定结果见表2.大量研究表明[20-33]：菌株LB1～LB7和H1分别具有不同功能，仅菌株LB4具有降解木质素、纤维素、废水、原油等的能力[24-27]，故在鉴定结果中选择菌株LB4(链霉菌Streptomycessp.)作为目标菌，对其木质纤维素降解能力进行测定，其菌落形态见图2，显微镜图见图3.

表2 菌株的DNA序列鉴定结果Tab.2 Results of 16S rDNA sequence analysis of the strains

图2 LB4菌株的平板菌落Fig.2 The flat colonies of strain LB4

图3 LB4菌株的显微形态(标尺=5 μm)Fig.3 The microphone of strain LB4 (scale bar = 5 μm)

2.3 木质素降解能力测定

接种菌株LB4培养45 d后，小叶榕枝条中的木质素和半纤维素含量降低(表3).菌株LB4接种量不同，小叶榕枝条中的木质素和半纤维素含量降幅不同.与对照相比，接种量5%、10%、15%的3个处理木质素含量降幅依次为3.79%、21.63%和22.48%，半纤维素含量降幅依次为23.55%、26.60%和22.56%.总体上，菌株LB4接种量为10%和15%时，木质素含量和半纤维素含量降幅均达显著性水平，但10%和15%的接种量间并无显著差异，综合性价比等因素考虑，菌株LB4用于降解园林废弃物的适宜用量为10%.

表3LB4菌株各处理样品中木质素、半纤维素、纤维素含量1)

Tab.3Thedeterminatedcontentsoflignin,celluloseandhemi-celluloseineachtreatmentofstrainLB4

处理接种量/%w/%木质素半纤维素纤维素CK017.66±0.62a23.27±0.06a54.95±1.82aT1516.99±1.51a17.79±0.67b52.64±0.06aT21013.84±0.64b17.08±0.50b55.27±2.32aT31513.69±0.28b18.02±1.07b56.67±1.15a

1) 表中数据为3次重复的平均值±标准误，同列数据后凡具有一个相同字母者表示差异不显著(P>0.05，Duncan’s法).

3 讨论与结论

园林废弃物高温好氧堆肥是实现其循环利用的理想途径，而利用生物方法加速园林废弃物降解又是提高园林废弃物资源化效率的有效方法[34].目前，国际上关于木质素降解菌的研究以真菌居多[35-37]，如白腐真菌，但此类菌属低温木质素降解菌，高温的园林废弃物堆体环境会影响其木质素降解率.本研究应用原位筛选从园林废弃物高温好氧堆体中提取出具有木质素降解功能的菌株，通过分子学鉴定，该菌为链霉菌Streptomycessp.，不仅开拓了筛选高温木质素降解菌的途径，而且将木质素降解菌的研究对象拓展至放线菌[38].木质素降解能力测定试验也表明该菌可显著降低小叶榕枝条木质素和半纤维素含量，当该菌发酵液接种量达到10%时，经45 d培养，小叶榕枝条中木质素含量降幅达21.63%，半纤维素含量降幅达26.60%.

本研究通过试验证实了从园林废弃物高温好氧堆体中提取的链霉菌Streptomycessp.具有一定的木质素降解能力，但该菌的特性、降解机理和接种量等都有待进一步研究.

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【责任编辑李晓卉】

Identificationanddegradationabilityoflignindegradationisoaltesfromlandscapingwastecompost

CHEN Ying, ZHANG Juntao, RUAN Lin

(Guangzhou Institute of Landscape Gardening, Guangzhou 510405, China)

【Objective】 A strain with the ability of lignin degradation was screened from landscaping waste compost.【Method】The obtained isolates were identified by molecular identification; the lignin degradation isolates were inoculated into sterilizedFicusmicrocarpavar.pusillifoliawattle to study the degradation ability, including analyses of the content of lignin, cellulose and hemicellulose of the wattle respectively.【Result and conclusion】 The results showed that the lignin degradation isolates were identified asStreptomycessp.Compared with non-inoculated treatments, samples inoculated with different dosages (5%, 10%, 15%) of the bacteria fermentation liquid intoFicusmicrocarpabroken branches, respectively, the lignin content could be reduced by 22.48%, hemicellulose content could be reduced by 26.60% after 45 d incubation.

landscaping waste; compost; lignin degradation strain; DNA identification

2013- 09- 02优先出版时间2014- 10- 03

优先出版网址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20141003.1116.006.html

陈 莹(1983—)，女，助理研究员，硕士，E-mail：fanchuanyu2006@163.com；通信作者：张俊涛(1981—)，男，助理研究员，硕士，E-mail：zjt811027@sohu.com

广东省科技计划项目(2011A030600002，2012A030600009);广州市科技和信息化局民生科技重大专项(201300000128)

陈 莹， 张俊涛， 阮 琳.园林废弃物堆肥中木质素降解菌的鉴定及其降解能力研究[J].华南农业大学学报，2014,35(6):94- 98.

S182

A

1001- 411X(2014)06- 0094- 05