改良愈疡方对溃疡性结肠炎模型小鼠肠道菌群的影响※

韩玉娜 朱叶珊 雷淼娜 张亚芳 聂欣宁

(河北省唐山市中医医院医保科，河北 唐山 063000)

改良愈疡方对溃疡性结肠炎模型小鼠肠道菌群的影响※

韩玉娜 朱叶珊1雷淼娜1张亚芳1聂欣宁1

(河北省唐山市中医医院医保科，河北 唐山 063000)

目的探讨改良愈疡方对右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎(UC)模型小鼠肠道菌群的影响及治疗作用。方法40只雄性C57BL/6小鼠按完全随机法分为正常组、模型组、治疗组、对照组各10只；正常组和模型组均用0.9%氯化钠注射液灌肠，治疗组给予改良愈疡方灌肠，对照组给予柳氮磺胺吡啶灌肠，共治疗14 d。观察结肠长度和质量变化，以及对UC小鼠细菌移位的影响。结果治疗组、对照组疾病活动指数(DAI)评分与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.01)；治疗组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。饮用DSS后各组小鼠结肠长度均有不同程度缩短，治疗组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，但与正常组相比较无统计学意义(P>0.05)，对照组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)；各组小鼠结肠质量比较，治疗组与正常组、对照组、模型组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结肠长度与质量之比比较，模型组明显低于正常组(P<0.01)，治疗组高于模型组和对照组(P<0.01，P<0.05)，正常组与治疗组比较差异无统计学意义(P>0.05)。小鼠肠系膜淋巴结细菌移位率模型组明显高于正常组、对照组(P<0.01)，治疗组未发现细菌移位，与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论中药灌肠有助于维持UC模型小鼠的肠道正常菌群，对实验性模型小鼠结肠黏膜屏障具有保护作用。

复方;疾病模型，动物;结肠炎，溃疡性；肠；灌肠；中药疗法

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)又称非特异性溃疡性结肠炎，是一种原因不明的炎症性肠病。主要表现腹泻、腹痛、黏液血便等，部分患者有发热、体质量减轻、贫血等全身症状，少数患者有关节炎、脊柱炎、结节性红斑等肠外表现。我们应用更接近人UC免疫学特点的右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的模型小鼠，通过改良愈疡方灌肠治疗，观察其对肠道菌群的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 40只雄性C57BL/6小鼠(体质量18～22 g，7～12周)，购于北京维通利华有限公司[合格证号:SCXK(京)2011-0009]。DSS购于Sigma公司。

1.2 分组和模型[1]40只小鼠按随机数随机分入正常组、模型组和治疗组和对照组，每组10只； DSS(分子量36 000～50 000)，10 g 溶于500 mL蒸馏水中，配成2%浓度，放入4 ℃冰箱保存。正常组小鼠自由饮用蒸馏水；其余3组自由饮用2%DSS 7 d。

1.3 药物及给药方法 改良愈疡方(白头翁15 g，穿山龙12 g，败酱草12 g，徐长卿9 g，仙鹤草15 g，地榆15 g，槟榔9 g，薏苡仁15 g)，原液每mL含生药3.0 g[相当于成人1.45 g/(kg·d)体质量]，由唐山市中医医院制剂室提供。4 ℃冰箱保存备用。1 mL/d灌肠。柳氮磺胺吡啶：上海三维制药有限公司，规格：250 mg/片，国药准字H31020450，批号：200609C15。将片剂用研钵研细，用100目筛筛过，用蒸馏水配成悬浊液，按0.30 g/kg体质量给药，1 mL/d灌肠。模型组给予等容积0.9%氯化钠注射液灌肠；治疗组给予改良愈疡方中药灌肠；对照组给予柳氮磺胺吡啶悬浊液灌肠。均14 d为1个疗程。

1.4 观察指标

1.4.1 观察造模期间动物的一般状况、结肠长度及质量变化 第15 d，颈椎脱臼处死小鼠，游离结肠，取出整个结肠，用预冷无菌的0.9%氯化钠注射液将结肠冲洗干净，观察并记录各组小鼠结肠的大体改变、测量整个结肠长度。参照疾病活动指数(DAI)评分标准[2](见表1)每日观察大鼠的体质量、粪便性状和隐血(联苯胺法测定)情况，并记录评分。

表1 DAI评分标准

DAI=(体质量下降分数+大便性状分数+便血分数)/3

1.4.2 各组小鼠肠系膜淋巴结细菌移位率 剪取全部肠系膜淋巴结，称质量后分别匀浆，将组织匀浆各0.1 mL在普通琼脂培养基上(涂菌法)培养24 h后(37 ℃孵箱中)，根据菌落稀释倍数计数菌落个数，换算成每g组织含菌量，用菌落形成单位(colony forming-unit，CFU)表示，每份标本均做双份培养。结果计算细菌移位率(细菌培养阳性只数/培养总只数)。

2 结 果

2.1 各组小鼠一般状况 实验期间，正常组小鼠反应灵活，毛色光润，喜活动，主动觅食，大小便正常；模型组第2 d开始精神萎靡，懒于活动，被毛松散无泽，拱背，食量下降，拉稀便或黏液血便，形态消瘦，体质量下降，活动、进食减少。对照组、治疗组治疗前与模型组基本相同，治疗后治疗组的大便较成形、血便及体质量减轻较不明显，一般状况优于模型组及对照组。

2.2 各组DAI评分比较见表2。

组 别nDAI评分治疗组101．23±0．15∗△◇对照组101．16±0．29∗模型组103．07±0．41正常组100．32±0．13

与模型组比较，*P<0.01；与对照组比较，△P<0.05；与正常组比较，◇P>0.05

由表2可见，治疗组、对照组疾病活动指数(DAI)评分与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.01)；治疗组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 各组小鼠结肠长度及质量变化比较 见表3。

表3 各组小鼠结肠长度及质量变化比较 ±s

与模型组比较，*P<0.01；与治疗组比较，#P<0.01;与对照组比较，△P<0.05；与正常组比较，◇P>0.05，○P<0.01

由表3可见，饮用DSS后各组小鼠结肠长度均有不同程度缩短，治疗组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，与正常组比较无统计学意义(P>0.05)，对照组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)；各组小鼠结肠质量比较，治疗组与正常组、对照组、模型组差异均有统计学意义 (P<0.01)。结肠长度与质量之比比较，模型组明显低于正常组(P<0.01)，治疗组高于模型组和对照组(P<0.01，P<0.05)，正常组与治疗组比较、对照组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 各组小鼠肠系膜淋巴结细菌移位率 见表4。

表4 各组小鼠肠系膜淋巴结细菌移位率比较

与治疗组、对照组比较，*P<0.01；与对照组比较，△P<0.01；与正常组比较，◇P>0.05

由表4可见，肠系膜淋巴结细菌移位率模型组明显高于正常组、对照组(P<0.01)，治疗组未发现细菌移位，治疗组与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

正常情况下，肠道上皮细胞和细胞之间的连接组成一道完整的黏膜屏障，阻止微生物及毒性大分子通过[3]。而肠黏膜屏障受损则可能是UC发病的始动因素。人体肠道处于复杂的带菌环境，而易感个体肠黏膜屏障通透性显著升高，使细菌通过肠黏膜屏障的机会增加，由此可见，及时清除黏附于肠壁表面和偶然突破肠黏膜屏障的致病菌是防止疾病发生和复发的关键。针对结肠黏膜屏障作用的治疗，与中医“未病先防，既病防变”的理论相切合。改良愈疡方正是基于上述理论指导治疗UC，从而为治疗UC提供新的办法，解除患者的病痛。方中白头翁、败酱草清热解毒，消痈止痛，现代药理研究表明，白头翁、败酱草可抗炎，促疮面愈合[4]，同时败酱草有利于提高血清超氧化物歧化酶 (SOD)及过氧化氢酶(CAT)的活性作用，有利于氧自由基的清除，减轻肠黏膜的损伤[5]。薏苡仁补脾除湿，同时也防止苦寒之品克伐脾胃，薏苡仁所含的薏苡仁油有镇痛止血作用[6]。仙鹤草、地榆凉血止血。穿山龙、徐长卿祛风化湿，解痉止痛，药理研究表明，二药可抗炎、抗免疫，具有类激素作用[7-8]；此外，徐长卿能抑制胃肠蠕动，缓解平滑肌痉挛，其对金黄色葡萄球菌有中度敏感，对甲型链球菌、伤寒杆菌、大肠杆菌和福氏痢疾杆菌等多种细菌有抑制作用[9]。槟榔苦泄辛散，善行气止痛、实肠止泻，取“行气则后重自除”之意。实验中饮用DSS后各组小鼠结肠长度均有不同程度缩短，但治疗后治疗组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，但与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明改良愈疡方可以阻止结肠的缩短，使结肠质量增加，这可能与改良愈疡方减少肠道炎症，促进溃疡愈合，减少瘢痕形成有关。正常结肠能长期暴露于大量菌群之中而不出现结肠细菌移位，是因为结肠黏膜屏障作用强，正常的结肠黏膜上皮连接紧密，离子通透性较差，具有较好的表面细菌清除能力。实验中，治疗组没有发现细菌移位，说明改良愈疡方能加强结肠黏膜的屏障保护作用。通过动物模型实验显示，改良愈疡方可有效改善症状，有效的控制细菌移位，其作用机制与保护结肠黏膜屏障有关，为临床应用提供了理论依据。

[1] 李林，王竹立，柯剑婷，等.实验性溃疡性结肠炎动物模型选择[J].世界华人消化志，2001，9(5):584-586.

[2] Cooper HS，Murthy SN，Shah RS，et al.Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis[J].Lab Invest，1993，69(2):238-249.

[3] Sheikh SZ，Plevy SE.The role of the macrophage in sentinel responses in intestinal immunity[J].Curr Opin Gastroenterol，2010，26(6):578-582.

[4] 孔增科，李利军，傅正良，等.败酱草、北败酱的鉴别与临床合理应用[J].河北中医，2009，31(2): 270-271，封3.

[5] 周金黄，王筠默.中药药理学[M].上海：上海科学技术出版社，1986:243-247.

[6] 陶小军，雷雪霏，李云兴，等.薏苡仁油的镇痛止血作用[J].中国实验方剂学杂志，2010，16(17):161-163.

[7] 仇华泉，苏酩，田景振.中药穿山龙治疗风湿病的研究进展[J].山东医药，2011，51(11):115-116.

[8] 赵丽萍.徐长卿研究进展[J].中国药业，2011，20(2):79-80.

[9] 戎聚全，莫永安，张朝卿，等.民族药徐长卿、半夏及紫苏子的民族民间应用[J].黔南民族医专学报，2003，16(2):63-64．

(本文编辑：李珊珊)

·信息·

广东简化单独两孩审批

5月6日，广东省卫生计生委下发通知明确，今后该省单独夫妇申请生育二孩，只需携带双方身份证、户口簿、结婚证、计划生育服务证的原件和复印件，到规定的审批机构领取并填写申请审批表，即可一站式办理全部手续。

这意味着，申请单独两孩的夫妇既无需父母回户籍地开具独生子女证明，也无需再持《再生育申请表》回各自单位盖章，申请流程大幅简化。此前需要提供的头胎子女出生证和独生子女证，亦不再需要。

InvestigationofmodifiedYuyangprescriptiononintestinalflorainmicemodelwithulcerativecolitis

HANYuna*，ZHUYeshan，LEIMiaona，etal.

*HealthDepartment,TangshanHospitalofTraditionalChineseMedicineinHebeiProvince,HebeiTangshan063000

ObjectiveTo investigate the effect of modified Yuyang prescription on intestinal flora in mice model with ulcerative colitis induced by dextran sodium sulfate (DSS).Methods40 male C57BL / 6 mice were randomly divided into normal group，model group，treatment group and control group，10 mice in each group; normal group and model group were given 0.9% sodium chloride injection enema，enema of traditional Chinese medicine was used in treatment group，the control group was given sulfasalazine enema for 14d. The changes of colon length and quality and bacterial translocation in UC mice were observed.ResultsThere was significant difference between treatment group，control group and model group on the score of disease activity index (DAI) (P<0.01). There was significant difference between treatment group and control group on the score of DAI (P<0.05). There was no difference between treatment group and normal group on the score of DAI (P>0.05). The colon length in each group was shorten in differ degrees after the treatment of DSS. There was significant difference between treatment group and model group on the colon length (P<0.01). But there was no difference between treatment group and normal group on the colon length (P>0.05). There was significant difference between control group and model group on the colon length (P<0.01). There was significant difference between treatment group，normal group，control group and model group on the colon quality (P<0.01). The ratio of colon length and quality in model group was lower than that in normal group (P<0.01). The ratio of colon length and quality in treatment group was higher than that in model and normal group (P<0.01，P<0.05). There was no difference between treatment group and normal group on the ratio of colon length and quality (P>0.05). Mesenteric lymph node bacterial translocation rate in model group was higher than in normal group and control group (P<0.01). There was no bacterial translocation in treatment group and there was no difference between treatment group and normal group (P>0.05).ConclusionChinese medicine enema contributes to maintenance of the intestinal tract normal bacteria flora in mice model with ulcerative colitis，and has protection on colonic mucosal barrier of experimental model mice.

Ulcerative colitis; Chinese medicine enema; Mucosal barrier

※ 项目来源：2012年唐山市科学技术研究与发展指导计划(编号：121302110b)

1 河北省唐山市中医医院脾胃病科，河北 唐山 063000

韩玉娜(1977—)，女，主治医师，学士。从事内科临床工作。

R-332;R282.710.7;R574.620.531

A

1002-2619(2014)05-0746-03

2014-01-15)