宫颈癌细胞周期素表达及意义

陈小燕 许三鹏 陶德定 李小兰 于世英

·论著·

宫颈癌细胞周期素表达及意义

陈小燕 许三鹏 陶德定 李小兰 于世英

目的研究宫颈癌组织中4种细胞周期素(cyclinA、cyclinB、cyclinD1、cyclinE)的表达，探讨4种cyclins与放射敏感性之间的关系。方法流式细胞术检测42例宫颈癌组织的4种cyclins。每周测量宫颈局部肿瘤大小，计算其消退50%时间(T0.5)。分析4种cyclins表达与放射敏感性(T0.5)的关系。结果宫颈癌组织cyclinA、cyclinB、cyclinD1、cyclinE均有不同程度过度表达，其阳性表达率分别为64.2%、83.4%、57.0% 和69.0%。cyclinA、cyclinE阳性的肿瘤其宫颈局部肿瘤消退50% T0.5值小，肿瘤消退快，放射敏感性好，差异有显著意义(P=0.033，P=0.023)。结论宫颈癌组织4种cyclins均过度表达。宫颈癌组织cyclinA、E的表达可作为放射敏感性的预测指标。

宫颈癌；细胞周期素；放射敏感性；流式细胞术

细胞周期调控机制破坏是肿瘤共同存在的普遍规律。细胞周期素(cyclin)作为细胞周期正向调控因素，在细胞周期事件的调控过程中起着关键作用，其表达规律的改变可能导致细胞的增殖失控和恶性转化，是许多癌基因、抑癌基因作用的主要汇聚点[1]。随着人们对细胞周期分子机制研究的进展，发现细胞周期是一系列cyclin共同调节的，其调控是一个动态的连续过程，因此，单一cyclin的变化不能全面反映其在细胞周期中的调控作用。本实验采用流式细胞术对4种cyclins表达水平进行半定量，分析它们与放射敏感性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2010年7月至2011年3月在华中科技大学同济医学院附属同济医院就诊的初治宫颈癌患者42例，治疗前均经病理学证实，均接受根治性放射治疗(体外照射加腔内治疗)。年龄32～65岁,平均45.7岁。其中鳞癌38例，腺癌4例。FIGO(国际妇产联盟)临床分期：Ⅱa期2例,Ⅱb期10例，Ⅲa期3例，Ⅲb期26例，Ⅳa期1例。放疗前和放疗10Gy后各取宫颈癌组织，制备成单细胞混悬液，80%乙醇固定于-20℃。收集7例行子宫切除术的非宫颈癌患者的正常宫颈组织作为正常对照。其中子宫肌瘤4例，卵巢囊肿2例，卵巢癌1例。

1.2 实验方法 表达cyclinA、cyclinB、cyclinE的Molt4细胞作为阳性对照。4种cyclin单克隆抗体(Pharmigen公司)分别加入细胞管中，4℃孵育过夜。IgG同型特异性抗体(Sigma公司)替代cyclin单抗作为阴性对照。PBS洗两遍。加入FITC- IgG荧光二抗(DAKO公司)，室温避光放置30 min。每管加入500 μl PBS,10 μl PI,10 μl Rnase，室温避光放置30 min。经双荧光标记的细胞用FACSORT流式细胞仪进行检测，获得cyclin/DNA双参数图像。每周1次测量宫颈局部肿瘤大小。记录放疗前肿瘤最大直径。计算宫颈局部肿瘤消退50%所需的时间(T0.5)，以天计算。

1.3 结果判断 结果用Cellquest软件处理分析，以阴性对照为参照，高于阴性对照即为阳性表达，获得cyclin值，以阳性百分数表示。

1.4 统计学分析 应用SPSS 11.5统计软件，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌组织细胞cyclinA、cyclinB、cyclinD1及cyclinE均有不同程度过度表达，其阳性表达率分别为64.2%、83.4%、57.0% 和69.0%。正常宫颈组织cyclinA、cyclinB、cyclinD1 和cyclinE均无表达。见图1。

2.2 宫颈癌组织cyclins表达与临床分期的关系 cyclinA、cyclinE值在不同临床分期之间存在显著差异(P=0.001；P=0.001)，并且随着临床分期增高，cyclinA、cyclinE值呈现逐渐下降趋势(r=-0.506,P=0.006；r=-0.440,P=0.022)。cyclinB、cyclinD1与临床分期无明显相关性(P=0.672，P=0.069)。见图2。

2.3 宫颈局部肿瘤消退50%的T0.5值与4种cyclins表达的关系 cyclinA、cyclinE阳性的肿瘤其宫颈局部肿瘤消退50%的T0.5值小，肿瘤消退快，放射敏感性好(P=0.033；P=0.023)。cyclinB、D1与T0.5之间无相关性(P=0.255，P=0.894 )。见表1。

图1 cyclins的表达

图2 cyclins表达与FIGO分期的关系

表1 cyclins表达与T0.5的关系

3 讨论

目前在哺乳动物细胞中发现了20多种cyclin。对细胞周期有明确调控作用的主要是cyclinA、B、D1～3和E。cyclins对细胞周期的调控主要表现在G1和M期。G1期cyclins主要包括cyclinD1、E。cyclinD1在G1早期表达，是细胞周期启动因子,它与CDK4结合使之活化，对Rb磷酸化，使细胞通过限制点(R点)进入S期。cyclinE主要在G1晚期发挥作用,是G1和S期转换的限速因子。CyclinE-CDK2复合物能使Rb因磷酸化而失活，使细胞从G1期进入S期。M期cyclin主要有cyclinA和B，在G2和M期交界处发挥作用，诱导细胞分裂。Cyclin的这种关卡机制保证分裂产生的子代细胞的DNA完整性。如果其失调，使本来应停止增殖或发生凋亡的细胞的DNA损伤或复制错误未能及时纠正，细胞就会带着错误信息进入周期循环而造成恶变[2]。

体外和多种人体肿瘤中均已观察到无限制表达的cyclin的致癌作用。50%的乳腺癌以及食管癌，头颈鳞癌中均观察到cyclinD1的过度表达[3]。有人对宫颈鳞状细胞癌组织进行cyclinE检测，并与宫颈不典型增生和正常宫颈组织进行比较，结果发现正常宫颈组织无cyclinE蛋白表达，宫颈不典型增生组织有少数表达，而在宫颈鳞状细胞癌中有58.52%表达[4]。本研究的结果显示，宫颈癌组织中cyclinA、B、D1、E的表达较正常组织明显升高，其阳性表达率分别为64.2%、83.4%、57.0% 和69.0%，正常宫颈组织中cyclinA、B、D1、E均无表达，与文献报道一致。说明cyclin过表达在宫颈癌的发生发展中起作用。

本研究还发现，宫颈癌的临床分期与 cyclinA、E的值之间存在显著差异(P<0.01 )，并呈负相关(r=-0.506，P=0.006；r=-0.440，P=0.022 )，即随着临床分期的升高，cyclinA、E的值呈下降趋势，与文献报道[5]一致，由此表明在肿瘤进展过程中cyclinA、E的表达并非呈直线上升，而是呈先上升再下降的趋势。在肿瘤发生的早期，细胞周期机制破坏的程度较轻，表现为细胞周期检测点的部分破坏，细胞周期仍须靠高表达cyclin的驱动使细胞越过检测点，完成在正常细胞周期调控机制下难以实现的肿瘤细胞克隆的增殖；而在肿瘤的晚期细胞周期检测点可能已完全被众多异常基因累积的共同作用所破坏，细胞在无检测的周期中运行，细胞周期易于启动，因而cyclin低表达。

关于cyclin与放射敏感性的关系的研究较少，且结论不一。Miyata等[6]报道在食管鳞状细胞癌中，用免疫组化方法检测cyclinD1和cyclinB1，放射敏感组

与放射耐受组的表达无显著差异；Shintan在41例口腔鳞癌和9株口腔鳞癌细胞系中检测到cyclinD1的过表达与放射敏感性的增加相关[7]；而Milas的研究表明，经15 Gy照射后，在高表达cyclinD1的SCC-VII放射抗拒肿瘤细胞系中未能诱导显著的凋亡和PCAN阳性细胞数变化，而在低表达cyclinD1的Oca-I细胞系中诱导出显著的凋亡和增殖细胞的减少[8]。本研究发现cyclinA、cyclinE的阳性表达率与宫颈局部肿瘤消退50%的T0.5值之间有显著差异，cyclinA、cyclinE表达阳性者其宫颈局部肿瘤消退50%的时间T0.5较短，对放疗的反应好，放射敏感，表达阴性者其T0.5较长，对放疗的反应差，放射敏感性差。

本实验通过检测宫颈癌组织4种cyclin，研究其与肿瘤消退50%T0.5、临床分期等因素的关系，发现宫颈癌组织4种cyclins均呈过度表达，cyclinA、cyclinE的过度表达与宫颈癌的恶性生物学行为及放射敏感性相关，可作为放射敏感性的预测指标。

1 Zucca E，Nigg EA.Cell cycle regulation and the function of cancer genes.Ann Oncol，1995，136: 961-964.

2 Qin J，Li L.Molecular anatomy of the DNA damage and replication checkpoints.Radiat Res，2003，159: 139-148.

3 Yu Q，Geng Y，Sicinski P.Specific protection against breast cancers by cyclinD1 ablation.Nature，2001，411:1017-1021.

4 Duman Schee IM，Weng L，Xin S，et al.Hedgehog regulates cell growth and proliferation by inducing cyclinD and cyclinE.Nature，2002，417:299-304.

5 Cho NH，Kim YT，Kim JW.Correlation between G1 cyclins and HPV in uterin cervix.Int J Gynecol Pathol，1997，73:339-347.

6 Miyata H，Doki Y，Yamamoto H，et al.Overexpression of CDC25B overrides radiation-induced G2-M arrest and results in increased apoptosis in esophageal cancer cells.Cancer Res，2001，61:3188-3193.

7 Shintani S，Mihara M，Ueyama Y，et al.Cyclin D1 overexpression associates with radiosensitivity in oral squamous cell.Int J Cancer，2001，96:159-165.

8 Milas L，Akimoto T，Hunter NR，et al.Relationship between cyclin D1 expression and poor radioresponse of murine carcinomas.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2002，52:514-521.

Expressionandsignificanceofcyclinsincervicalcarcinoma

CHENXiaoyan,XUSanpeng,TAODeding,etal.DepartmentofOncology,ShunyiDistrictHospitalofBeijing,Beijing101300,China

ObjectiveTo investigate the expression of human major cyclins (cyclinA,cyclinB,cyclinD1,cyclinE),and to explore the correlation between their expression and radiosensitivity in cervical carcinoma.MethodsThe expression levels of the four kinds of cyclins were detected by flow cytometry in 42 cases of local advanced cervical carcinoma tissues before radiotherapy and after treatment with 10 Gy radiation.The time for the tumor to diminish a half (T0.5) was calculated every week.The correlation between the expression of the four kinds of cyclins and radiosensitivity (T0.5) was analyzed.ResultsThe positive expression rates of cyclinA,cyclinB,cyclinD1,cyclinE in cervical carcinoma were 64.2%,83.4%,57.0%,69.0%,respectively.The T0.5 value in tumors with positive cyclinA and cyclinE was significantly lower (P<0.05),moreover their radiosensitivities were better.ConclusionThe overexpression of cyclinA,cyclinB,cyclinD1,cyclinE exists in cervical carcinoma,which can be used as prediction index for evaluating radiosensitivity in cervical carcinoma.

cervical carcinoma; cyclins; radiosensitivity; flow cytometry

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.10.002

101300 北京市顺义区医院肿瘤科

于世英，101300 北京市顺义区医院肿瘤科；

E-mail：syyu@tjh.tjmu.edu.cn

R 737.33

A

1002-7386(2014)10-1448-03

2013-11-20)