北京地区携带OXA-1型超广谱-内酰胺酶志贺菌耐药特点研究

苗元 卢立新 吴本和 王永全 靳博 崔京辉 张晶波 王全意

·药物研究·

北京地区携带OXA-1型超广谱-内酰胺酶志贺菌耐药特点研究

苗元 卢立新 吴本和 王永全 靳博 崔京辉 张晶波 王全意

目的了解本地区志贺菌中携带OXA-1型超广谱β-内酰胺酶(exteneded spectrum beta-lactamases,ESBLs)耐药基因型及耐药特征。方法收集2008至2011年分离出的志贺菌83株，聚合酶链反应(PCR)检测OXA-1型耐药基因，阳性产物序列在GenBank上比对确定基因亚型；对携带OXA-1型耐药基因菌株按照Kirby-Bauer法进行药物敏感性试验，测定志贺菌对8种头孢类抗生素耐药情况。结果83株志贺菌中，21株携带OXA-1型ESBLs基因，阳性率为28.57%，其中21株福氏志贺菌检出15株，61株宋内志贺菌检出6株。阳性产物均为OXA-1亚型。药敏结果显示，携带OXA-1型基因菌株对头孢噻吩、头孢唑林等头孢类抗生素耐药，对头孢西丁、头孢他啶、头孢吡肟和头孢哌酮等头孢类抗生素均敏感。结论本地区志贺菌中以携带OXA-1亚型ESBLs耐药基因为主，在福氏志贺菌中检出高于宋内志贺菌，该基因与志贺菌对头孢类抗生素的耐药性呈一定相关性。

志贺菌；超广谱β-内酰胺酶；OXA-1型；耐药性

OXA型广谱β-内酰胺酶(exteneded spectrum beta-lactamases,ESBLs)是从20世纪80年代后期从丝氨酸β-内酰胺酶中分离，在分子分类上属于D类，功能分类上属于2d类ESBLs[1]，是对头孢类抗生素耐药的重要原因之一。OXA型ESBLs有OXA-1、OXA-2和OXA-10三个基因来源，但同源性仅为20%～30%，在分子水平上OXA型ESBLs分为5组，其中第Ⅲ组包括OXA-1、OXA-4、OXA-30和OXA-31等亚型[2]。在志贺菌中，携带OXA型酶菌株也常有报道，但检出以OXA-1型ESBLs为主。为此，本研究收集了2008至2011年本地区从腹泻患者粪便标本中分离出的连续的不重复的志贺菌共83株，研究其OXA-1型ESBLs耐药基因检出情况，并对其进行耐药性分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2008至2011年本辖区内北京儿童医院、北京大学人民医院、北京大学第一医院，积水潭医院等10家肠道门诊开诊期间上送菌株及本实验室从腹泻病患者粪便标本中分离培养的志贺菌共83株，其中福氏志贺菌21株，宋内志贺菌61株，鲍氏志贺菌1株。

1.2 OXA-1型ESBLs耐药基因检测 采用煮沸法提取菌体及质粒DNA。OXA-1型耐药基因引物序列为：正向引物5’-ACACAATACATATCAACTTCGC-3’，反向引物5’-AGTGTGTTTAGAATGGTGATC-3’。反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，30循环；72℃延伸10 min。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，美国Bio-Rad公司凝胶成像系统照相。引物序列由大连(宝)生物工程有限公司合成。

1.3 OXA-1型基因DNA测序及序列分析 PCR扩增在美国Bio-Rad公司的iCycler PCR上进行， PCR阳性扩增产物委托北京金螺旋生物科技公司纯化、测序。测序使用双脱氧末端终止法，在ABI3730XL测序仪上进行双向测序，序列拼接后通过NCBI BLAST程序在GenBank上查询比较，确定基因亚型。

1.4 药物敏感性试验 根据PCR扩增结果，将携带OXA-1型耐药基因菌株，按照CLSI推荐的Kirby-Bauer法进行药物敏感性试验测定对8种头孢类抗生素耐药情况。抗菌药物头孢噻吩、头孢唑林、头孢西丁、头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟、氨曲南及MH培养基干粉购自英国Oxoid公司。质控菌株使用大肠埃希菌ATCC25922。

2 结果

2.1 OXA-1基因PCR检测结果 83株志贺菌中共有21株检出OXA-1型核酸阳性，阳性率为25.3%(21/83)。其中福氏志贺菌中检出15株，宋内志贺菌中检出6株。对核酸阳性的产物进行测序，将测序结果拼接后，在GenBank上经BLAST比对，全部为目的序列，无假阳性出现，基因亚型为OXA-1亚型。见表1。

表1 不同血清型志贺菌OXA型耐药基因检出结果

2.2 携带OXA-1型耐药基因菌株药敏试验结果 根据核酸检测结果，对检出携带OXA-1型耐药基因的21株志贺菌进行药敏试验。实验结果判定根据Oxoid药敏纸片说明书中规定肠杆菌科的抑菌环直径解释标准，判定耐药(R)和敏感(S)。21株携带OXA-1型耐药基因的志贺菌菌株对头孢噻吩的耐药性最高，耐药率为61.90%，其次为头孢唑林，耐药率为28.57%。对头孢噻肟、氨曲南等头孢类抗生素有一定耐药性，耐药率都达到19.05%。对头孢西丁、头孢他啶、头孢哌酮和头孢吡肟较敏感，耐药率最高不超过10%。见表2。

表2 携带OXA-1型耐药基因菌株药敏试验结果 株

3 讨论

有研究表明OXA型β-内酰胺酶在不同类微生物体内水解β-内酰胺抗生素能力存在差异[3]，早期的文献报道OXA型β-内酰胺酶主要存在于铜绿假单胞菌[4]和鲍曼不动杆菌[5]中，而在志贺氏菌中偶有发现[6]。但随着近年志贺菌耐药现象日益严重及对耐药机制的研究深入，志贺菌中检出OXA型β-内酰胺酶的报道逐渐增多。在国内，叶颖子等[7]2008年从51株福氏志贺氏菌中检出45株携带OXA-1群ESBLs基因，阳性率高达88.2%；纪文静等[8]从2004-2008年期间搜集的59株志贺菌中检出6株携带OXA-1亚型ESBLs基因；本实验对83株志贺氏菌进行检测后发现，21株发现携带OXA-1亚型ESBLs基因，阳性率为25.3%。阳性率产生差异的原因与各地区用药习惯不同有一定关系，但本研究发现OXA-1亚型ESBLs耐药基因在福氏志贺菌中检出率高于宋内志贺菌，如此次从61宋内志贺菌中只检出6株(9.8%)携带OXA-1亚型耐药基因，从21株福氏志贺菌检出15株(71.4%)携带OXA-1亚型耐药基因，福氏志贺氏菌OXA-1耐药基因阳性率与叶颖子等的研究结果相近(88.2%)。而鲍春梅等[9]从43株多重耐药宋内志贺菌中未检出OXA基因实验结果也证实该基因在宋内志贺菌中检出率偏低，此发现为国内首次报道。

该酶之所以命名为OXA型酶，是因为其除耐氨苄西林、头孢噻吩外，对其他头孢菌素的水解能力不一，但对苯唑西林、氯唑西林有很强的水解能力[10]。有国内学者指出，是否携带OXA耐药基因与志贺菌对β内酰胺类抗生素的耐药率无关[8]。但本研究发现，携带OXA耐药基因志贺菌对头孢噻吩的耐药率达到61.9%，对头孢唑林的耐药率达到28.6%，对头孢噻肟、氨曲南等头孢类抗生素有一定耐药性。耐药菌株中只有少部分携带其它ESBLs类耐药基因，如CTX-M、TEM、SHV等(另文发表)，说明其对头孢类抗生素会产生一定耐药性。

由于编码OXA型酶的基因常位于质粒和整合子中，具有很强的扩散能力，所以控制其流行传播刻不容缓。因此加强对该类型ESBLs耐药基因的监测，并结合药物敏感性实验结果，以期达到指导临床合理使用抗菌药物，延缓细菌耐药性产生，控制耐药菌株的传播以及研发稳定、高效抗菌药物方面具有十分重要的意义。

1 张卓然,夏梦岩,倪语星主编.微生物耐药的基础与临床.第1版.北京:人民卫生出版社，2007.127-130.

2 Bert F,Branger C,Lambert-Zechovsky N.Identification of PSE and OXA -lactamase genes in Pseudamanas aeruginosa using PCR-restriction fragment length polymorphism.J Antimicrob Chemother,2002,50:11-18.

3 周伟琳,俞云松,马亦林.超广谱β-内酰胺酶的分类.中国抗感染化疗杂志,2002,12:245-248.

4 weldhagen G，Poirel L，Nordmann P．Ambler class A exterlded-spectrum beta-lactamases in Pseudomonas aeruginosa:novel developments and clinical impact.Antimicrob Agents Chemother,2003,47:2385-2392．

5 Boo TW,Walsh F,Crowley B.First report of OXA-23 carbapenemase in clinical isolates of Acinetobacter species in the Irish Republic.J Antimicrob Chemother,2006,58:1101-1102.

6 Siu LK,Lo JY,Yuen KY,et al.β-lactamases in Shigella flexneri solates from Hong Kong and Shanghai and a Novel OXA-1-like β-lactamases,OXA-30.Antimicrob Agents Chemother,2000,44:2034-2038.

7 叶颖子,俞蕙,王晓红，等.儿童福氏志贺菌OXA型β内酰胺酶耐药基因及其耐药性检测.中国实用儿科杂志,2008,9:687-689.

8 纪文静,徐樨巍,董方.儿科产超广谱β-内酰胺酶志贺菌的基因型和耐药性研究.中华微生物和免疫学杂志，2010,30:472-476.

9 鲍春梅,郭桐生,崔恩博，等.产ESBLs宋内志贺菌耐药基因分布研究.军事医学,2011,2:122-127.

10 刘晓一,刘文恩.OXA型超广谱β-内酰胺酶的研究进展.中国感染控制杂志,2010,6:462-467.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.07.055

项目来源:北京市西城区科技计划项目(编号：XCKJJH2013-27)

100120 北京市西城区疾病预防控制中心检验科(苗元、卢立新、吴本和、王永全、靳博、崔京辉、张晶波)；北京市疾病预防控制中心(王全意)

R 96

A

1002-7386(2014)07-1081-02

2013-10-12)