应用SELDI-TOF MS技术筛选乳腺癌蛋白标志物

肖代雯,杨永长,腾飞鹏,刘 华,黄文芳

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其死亡率仅次于肺癌位于第二位[1]。目前乳腺癌治疗的10年生存率尚无明显改善，主是是因为大部分患者发现时已到中晚期。因此，寻找乳腺癌诊断的特异性标志物，对乳腺癌的诊断治疗具有重要的意义。表面增强激光解析电离飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, SELDI-TOF MS)是近年发展起来的一种蛋白组学研究方法，利用这一技术可对血清、尿液、细胞裂解液和细菌等样品进行直接检测，具有高灵敏性、高通量特点。现已广泛应用于结肠癌、肺癌、糖尿病和细菌感染等疾病的诊断研究[2-5]。美国食品和药物管理局(FDA)和美国国立癌症研究所(NCI)已应用该技术建立了卵巢癌的诊断模型，并于2004年在美国开始应用于临床卵巢癌的筛查。本实验拟应用SELDI-TOF MS筛选乳腺癌的蛋白标志物，建立诊断模型，为乳腺癌的快速诊断奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料 2007年10月-2008年2月我院收治的乳腺癌患者35例，乳腺良性病变患者35例。乳腺癌和乳腺良性病变患者血清都于术前收集，且均经术后病理确诊。另采集正常人血清18例。于清晨采集受试者血清3 ml,30 min内放于4℃冰箱中，分出血清后4℃离心5 min，血清转入一干净EP管中，50 μl/管进行分装，冻存于-80℃冰箱中备用。

1.2方法 仪器及试剂：无水醋酸钠(NaAc)、芥子酸(SPA)、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)，甲酸和蛋白分子量标准品购自Sigma公司；SELDI-TOF MS、CM10蛋白芯片、Proteinchip Software和Biomarker Pattern分析软件购自美国Ciphergen Biosystems。

1.2.1蛋白分子量校准 采用Sigma蛋白标准品insulin(MW5733.49)，Cytochrome C(MW12 230), Myoglobin(16 950)对SELDI-TOF-MS进行分子量校准。

1.2.2CM10芯片的活化及标本上样 血清分为2组：乳腺癌组(包括35例乳腺癌)及对照组(包括35例乳腺良性病变患者及18例正常人)。CM10芯片装入芯片处理器，每孔加入150 μl，50 mM醋酸钠，振荡5 min，甩干，重复1次；将芯片处理器置于冰上，每孔加入80 μl标本，冰上振荡1个小时；每孔加入150 μl,50mM醋酸钠，振荡5 min，甩干，重复3次；每孔加入150 μl HPLC水瞬时洗两次，甩干；室温自然干燥约15 min。

1.2.3血清蛋白质谱的检测 芯片干燥后，每孔加入1 μl SPA，室温放置约15 min，自然干燥，重复1次。SELDI TOF MS测定血清蛋白，激光强度设为190，灵敏度为8，优化相对分子质量范围3 000～20 000。采用Ciphergen proteinchip分析软件自动采集数据。

1.3统计学方法 采用Ciphergen Biomaker Wizard软件分析癌症组和对照组血清蛋白指纹图谱，设定有意义的蛋白质峰出现频率阈值为10%，信噪比设定为7，对不同组数据进行t检验，P<0.01的蛋白质峰差异具有统计学意义。用Biomarker Pattern软件建立乳腺癌诊断的分类树模型。

2 结果

2.1血清蛋白质图谱的检测 经质谱检测和Ciphergen Proteinchip 3.0软件分析，在质荷比3 000～30 000范围内共检测到59个蛋白质峰，其中有19峰表达具有明显差异(P<0.01),见表1及图1。与对照组相比，有8个蛋白质在乳腺癌中高表达，11个呈低表达。

表1 乳腺癌组与对照组5个蛋白质峰比较

注：0对照组;1乳腺癌组。

A正常人 B乳腺良性病变 C和D 乳腺癌图1 乳腺癌组与对照组部分蛋白质峰比较

2.2乳腺癌诊断模型的建立 采用Biomarker Pattern软件对差异蛋白进行分析，以质荷比为M6636.62，M13889.6建立的分类树诊断模型，诊断的准确率达到94.3%,灵敏度和特异度分别为80.0%(28/35)和71.7%(38/53)。见图2。

3 讨论

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，据中国肿瘤登记处统计，乳腺癌的死亡率排在中国城市女性肿瘤死亡率的第4位。乳腺癌的自然病程以临床前期最长，约占总病程的2/3，早期癌中大多无明显包块或肿块较小，等出现明显肿块时，半数已有淋巴或血行转移。目前乳腺癌的诊断检查方法主要有：钼靶摄片、选择性乳腺导管造影、针吸细胞学检查及分子生物学检测等。这些方法对有明显包块的患者诊断率约为60%左右[6]，但对于肿块直径小于0.5 cm，准确率极低。而乳腺癌血清标志物，如CA153和CA27等，均存在表达水平低，敏感性和特异性差等问题。因些，寻找一种高灵敏性、高特异性的诊断方法成为目前临床的迫切需要。

图2 乳腺癌的分类树诊断模型图

目前，蛋白质组学的研究得到了空前的发展，出现了大量的研究方法并应用于临床，利用这些技术人们发现了许多的疾病标志物[7-9]。其中，2002年诺贝尔化中学奖获得者田中发明了表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)，该技术在吸收传统质谱技术的基础上，克服了常规蛋白组学检测技术的一些缺点，具有检测速度快，样本用量小，蛋白质分子质量范围大，重复性较好，敏感性，特异性较高等特点。利用这一技术可对血清、尿液、细胞裂解液等生物样品直接进行检测，能基本反映被检样本中蛋白质的全貌，进而可以发现蛋白质的变化，为疾病的早期诊断、复发或转移的监测提供了可能。

本研究利用SELDI-TOF-MS技术，选择CM10蛋白芯片，对乳腺癌患者血清及对照组血清(包括乳腺良性病变及正常人)差异表达蛋白进行分析。研究证明乳腺癌组及对照组血清蛋白质谱图有19个蛋白峰表达具有明显差异(P<0.01)。以2个蛋白质峰(质荷比分别为M6636.62，M13889.6)建立的诊断模型，对乳腺癌的诊断的准确率达到94.3%,灵敏度和特异度分别为80.0%和71.7%。

应用SELDI-TOF-MS技术可以提供大量完善动态的蛋白指纹图谱，在各种疾病的诊断和治疗方面发挥一定的作用，随着技术的不断改进和标准化，这一技术有望应用于临床，在人类战胜恶性疾病中发挥重要作用。

【 参 考 文 献 】

[1] 胡 跃，张苏展，余捷凯，等.乳腺癌患者血清蛋白质指纹图谱检测及其临床意义[J].中华检验医学杂志，2004，27(10)：646-648.

[2] Zhou ZY,Tao DD,Cao JW,et al.Application of surface enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry technology for the diagnosis of colorectal adenoma[J].Oncol Lett，2013，5(6):1935-1938.

[3] Simsek C,Sonmez O,Keyf AI, et al.Importance of serum SELDI TOF MS analysis in the diagnosis of early lung cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev，2013，14(3):2037-2042.

[4] Sundsten T,Ostenson CG,Bergsten P.Serum protein patterns in newly diagnosed type 2 diabetes mellitus-influence of diabetic environment and family history of diabetes[J].Diabetes Metab Res Rev，2008,2:148-154.

[5] 肖代雯,杨永长,刘 华,等.用表面增强激光解析/电离飞行时间质谱蛋白指纹快速鉴定4种临床常见菌[J].中华微生物学和免疫学杂志，2012,32(6):566-570.

[6] 张国强，杜 杰，庞 达.表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术筛查乳腺癌血清特异性蛋白质及其临床意义[J].中华肿瘤杂志，2006，28(3)：204-206.

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[8] Xue A,Gandy RC,Chung L,et al.Discovery of diagnostic biomarkers for pancreatic cancer in immunodepleted serum by SELDI-TOF MS[J].Pancreatology，2012,12(2):124-129.

[9] Wegdam W,Moerland PD,Meijer D,et al.A critical assessment of SELDI TOF MS for biomarker discovery in serum and tissue of patients with an ovarianmass[J].Proteome Sci，2012,10(1):45.