鱼肉中磺胺类抗生素的表面增强拉曼光谱探测与分析

马海宽，韩晓红，张财华，张 旭，史晓凤，马 君

(中国海洋大学光学光电子实验室， 山东 青岛 266100)

0 引言

二十世纪三十年代，磺胺类抗生素被发现可有效治疗感染性疾病后，被长期用于临床治疗[1]。近年来，磺胺类抗生素在水产品养殖业中的滥用对人体健康及生态环境产生严重的危害。目前国内外对磺胺类抗生素残留的检测方法主要包括理化检测法、生物测定法及免疫分析法[2]。这些方法虽然灵敏度比较高，但是仪器和材料价格昂贵，操作复杂，很难实现现场探测。目前，急需一种可检测水产品中残留痕量抗生素的简单、快速、便捷的方法。

表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman Spectroscopy, SERS)技术具有简单、快速、方便、高灵敏度、高准确度的痕量检测等优点，当检测分子发生谐振时，增强效果可达1014-1015倍[3, 4]，在理论上可达到单分子检测的水平，在多个领域已被广泛应用。近年来，国内外多个研究小组相继将SERS技术应用于对抗生素的检测与分析，并取得了一定的成果。2006年，罗马尼亚的Lliescu[5]等人利用银溶胶作为增强基底对青霉素钾进行了拉曼光谱探测。2011年，中国科学技术大学的陈乾旺[6]等人制备了空心金纳米材料，并以此为增强基底对四环素溶液进行SERS光谱检测，能够检测到的最低浓度为0.1 ppb。2013年，上海海洋大学的赖克强[7]等人用购买的Klarite材料作增强基底对鱼肉中孔雀石绿和结晶紫进行SERS光谱探测，能够检测的最低浓度分别为10 ppb和15 ppb。2013年，中国海洋大学马君[8]等利用自组装法制备了银溶胶膜，使用显微拉曼系统对氯霉素、环丙沙星和恩诺沙星进行了SERS光谱探测，最低检测浓度分别为40 ppb、5 ppb、40 ppb。

本文通过制备高灵敏度的银溶胶，探测分析了鱼肉中磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的SERS光谱，确定了提取上述物质的最佳提取方法，并计算了两者在鱼肉中的检测限。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

氢氧化钠、氨水、硝酸银、柠檬酸三钠、盐酸、硝酸、无水硫酸钠等均购于国药集团化学试剂有限公司；水产品中限制使用的两种磺胺类抗生素(磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶)由上海源叶生物科技有限公司提供；比目鱼购自超市；甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正己烷来自天津科密欧化学试剂有限公司；去离子水为中国海洋大学化学学院自制。所有试剂和药品均为分析纯，使用时未进一步提纯。

1.2 实验仪器

磁力搅拌器(RCT basic，德国IKA公司)；超声清洗器(KQ2200DB，昆山超声仪器公司)；恒温干燥箱(DHG-9037A，上海精宏实验设备厂)；微波炉(MM823ESJ-PA，美的集团有限公司)；离心机(TG16-WS，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；扫描电子显微镜(S-4800，日本日立公司)

光谱仪为美国Ocean optics公司生产的新一代QE65Pro便携式拉曼光谱仪，光栅刻痕密度为900 g/mm，光谱分辨率为10 cm-1。光源采用VA-I-N532固体连续激光器，激发波长为532 nm，激光最大功率为400 mW。

1.3 实验方法

1.3.1 银溶胶的制备

将150 mL、0.02%的硝酸银溶液放入微波炉中加热[9]。溶液沸腾后，放入热水浴中，900 r/min搅拌，同时缓慢加入4 mL、1%的柠檬酸钠溶液，2 min后放回微波炉中继续加热9 min后取出冷却至室温。

1.3.2 标准溶液的配置及鱼肉中抗生素的提取

以氨水、乙酸乙酯作为溶剂，分别配置浓度为50 ppm、30 ppm、20 ppm、15 ppm、12 ppm、10 ppm、8 ppm、5 ppm、2 ppm、1 ppm的磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶标准溶液待用。

为排除鱼肉中脂肪和蛋白质等大分子对光谱的影响，鱼肉中抗生素的提取方法非常重要。主要包括匀浆、离心、去脂、定容这四个步骤。首先，将1 g鱼肉、1 mL抗生素标准溶液和提取剂混合，匀浆使鱼肉与抗生素充分混合；再将匀浆后的混合物离心取出上清液，向残渣中加入一定量的提取剂，重复提取一次，合并上清液；进一步将上清液水浴蒸发浓缩至近干，加入一定量的甲醇与正己烷，离心去除正己烷，以去除鱼肉中油脂类物质；最后，用提取剂定容至10 mL，得待测物提取液。 4 ℃保存，用于SERS光谱测定。

2 实验结果与结论

光谱数据分析采用Origin8.1软件进行平滑和去基线处理，光谱探测时，到达样品的激光功率为50 mW，积分时间为10 s，每个样品探测五次进行平均。

2.1 银溶胶的表征

经微波加热法制备的银溶胶颜色为棕绿色，扫描电镜图(Scanning election microscope SEM)及紫外可见吸收光谱如图1所示，可以看出银纳米颗粒是不规则的球状，粒径大小较为均匀，粒径范围在45-65 nm之间，吸收峰位于424 nm。

图1 银溶胶的扫描电镜图及消光光谱Fig.1 Scanning election microscope image and extinction spectrum of silver colloid solution

2.2 鱼肉中抗生素的SERS探测

2.2.1 磺胺甲基嘧啶与磺胺二甲基嘧啶固体拉曼光谱分析

从分子结构上看，磺胺甲基嘧啶与磺胺二甲基嘧啶只在嘧啶环上相差一个甲基，为了分析其拉曼效应的异同，取少许磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶固体进行拉曼光谱的探测，图2为获得的典型光谱图。

图2 典型磺胺类抗生素固体拉曼光谱. (a) 磺胺甲基嘧啶; (b) 磺胺二甲基嘧啶Fig.2 Typical Raman Spectra of solid sulfonamide antibiotics. (a) sulfamerazine; (b) sulfamethazine

通过对比两者的拉曼光谱发现，其主要特征峰大致相似，分别为：1 636 cm-1(1 644 cm-1)、1 598 cm-1(1 598 cm-1)处的对位二取代苯环伸缩振动，1 512 cm-1(1 512 cm-1)、1 417 cm-1(1 417 cm-1)处的嘧啶环伸缩振动，1 374 cm-1(1 386 cm-1)的嘧啶环呼吸振动，842 cm-1(838 cm-1)、747 cm-1(719 cm-1)、685 cm-1(686 cm-1)处的对位二取代苯环呼吸振动。表1列出了磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶主要拉曼峰及其归属[10]。从表1可知磺胺甲基嘧啶相比磺胺二甲基嘧啶分别在1 564 cm-1、1 194 cm-1处出现了明显的拉曼峰，依次代表嘧啶环的伸缩振动、嘧啶环的呼吸振动。分析原因，主要由于两种物质分子结构上的差异，磺胺甲基嘧啶结构中嘧啶环为2,4-双取代，而磺胺二甲基嘧啶中嘧啶环为2,4,6-三取代。嘧啶环中的2,4,6-三取代使得嘧啶环结构对称性更好，影响了嘧啶的拉曼活性，从而影响嘧啶环的伸缩和呼吸振动，导致部分拉曼峰的缺失。

2.2.2 提取剂的确定

由于磺胺类抗生素易溶于部分有机溶剂和铵盐溶液，实验中分别以乙酸乙酯和pH=10的氨水作为抗生素标准溶液的溶剂和鱼肉中抗生素的提取剂。实验中发现，两种溶剂配置的磺胺类抗生素标准溶液的SERS光谱探测均具有较好的效果，且氨水作为溶剂时效果更佳。但在用氨水对鱼肉中磺胺类抗生素进行提取的过程中，发现溶液极易变浑浊，而用乙酸乙酯作为提取剂时得到的提取物溶液无色透明。图3 为两种提取剂的鱼肉中磺胺甲基嘧啶的SERS光谱图。

图中显示，用乙酸乙酯作为提取剂时，磺胺甲基嘧啶增强效果好，探测灵敏度高，能够检测到1 605 cm-1、1 551 cm-1、1 342cm-1、1 197 cm-1、1 102 cm-1、734 cm-1处的主要特征峰，相对于固体拉曼光谱，其峰位有十个左右波数的偏移。用氨水作为提取剂时，受鱼肉中大分子信号干扰大，对磺胺甲基嘧啶的探测效果差，信噪比低，仅能够探测到磺胺甲基嘧啶在1 605 cm-1和734 cm-1处微弱的峰。究其原因，可能是因为氨水溶液与鱼肉中的大分子蛋白质发生某些反应，导致溶液变浑浊，影响了磺胺甲基嘧啶的提取和增强吸附。因此，实验中均选取乙酸乙酯作为定容溶剂和提取剂。

表1 两种磺胺类抗生素主要拉曼峰归属[10]Tab.1 Raman bands of two kinds of sulfa antibiotics

图3 两种提取剂的鱼肉中磺胺甲基嘧啶的SERS光谱图及银溶胶溶液和纯鱼肉拉曼光谱. (a) 银溶胶, (b) 纯鱼肉, (c，d)为分别采用氨水、乙酸乙酯提取鱼肉中磺胺甲基嘧啶；(e) 磺胺甲基嘧啶固体Fig.3 SERS Spectra of sulfamerazine in different solution extracted from fish and Raman spectrum of gold colloid solution and fish. (a) silver colloid, (b) fish fresh, (c, d) sulfamerazine extracted from fish fresh in ammonia water and ethyl acetate respectively, (e) solid sulfamerazine

2.2.3 鱼肉中磺胺类抗生素的检测

以乙酸乙酯作为提取剂，按1.3.2中方法对鱼肉中的不同浓度的磺胺类抗生素进行提取，提取液与银溶胶1∶1混合，进行SERS光谱探测。图4为磺胺甲基嘧啶固体拉曼光谱及鱼肉中不同浓度的磺胺甲基嘧啶提取液的SERS光谱。如前所述，相对于磺胺甲基嘧啶固体的拉曼光谱，提取液中能够检测到1 605 cm-1、1 551 cm-1、1 342 cm-1、1 197 cm-1、1 102 cm-1、734 cm-1的主要特征峰。但相对于磺胺甲基嘧啶固体的拉曼峰大约有3～15个波数的频移，可能是纳米银颗粒与吸附的磺胺甲基嘧啶发生电荷转移，从而引起拉曼峰的漂移。当浓度为1 ppm时，在1 605 cm-1和1 102 cm-1处仍还存在微弱的磺胺甲基嘧啶的拉曼特征信号，因此可检测到在鱼肉中的浓度为1 ppm的磺胺甲基嘧啶。

图4 鱼肉中不同浓度磺胺甲基嘧啶提取液的SERS光谱及银溶胶溶液和纯鱼肉拉曼光谱. (a) 银溶胶, (b) 纯鱼肉提取液, (c, d, e)鱼肉中不同浓度(1 ppm, 5 ppm 和50 ppm)磺胺甲基嘧啶提取液, (f) 磺胺甲基嘧啶固体Fig.4 SERS Spectra of sulfamerazine solution with different concentration extracted from fish and Raman spectrum of gold colloid solution and fish. (a) silver colloid, (b) solution extracted from fish, (c, d, e) sulfamerazine solution with different concentration (1 ppm, 5 ppm and 50 ppm) extracted from fish fresh, (f) solid sulfamerazine

图5为鱼肉中磺胺甲基嘧啶1 102 cm-1处的特征峰峰强与浓度之间的关系曲线。可以看出，峰强随浓度的升高而升高，在低浓度范围内呈线性关系。经LOD公式计算[11]，鱼肉中磺胺甲基嘧啶的检测限约为0.16 ppm。

图5 鱼肉中磺胺甲基嘧啶的特征峰强度与浓度变化关系曲线Fig.5 Dependence of peak intensity of sulfamerazine in fish on Concentration

图6为磺胺二甲基嘧啶固体及鱼肉中不同浓度的磺胺二甲基嘧啶提取液的SERS光谱。从图中可知，对鱼肉中的磺胺二甲基嘧啶进行提取后，探测到的磺胺二甲基嘧啶的拉曼特征峰相对较少，且在1 601 cm-1、1 024 cm-1、859 cm-1处出现了鱼肉中大分子蛋白质的拉曼特征峰。在浓度不低于1 ppm时可以检测到1 134 cm-1处的磺胺二甲基嘧啶的拉曼特征信号，因此可检测到在鱼肉中的浓度为1 ppm的磺胺二甲基嘧啶。

图6 鱼肉中不同浓度磺胺二甲基嘧啶提取液的SERS光谱及银溶胶溶液和纯鱼肉拉曼光谱. (a) 银溶胶, (b) 纯鱼肉提取液, (c, d, e)鱼肉中不同浓度(1 ppm, 5 ppm, 50 ppm)磺胺二甲基嘧啶提取液, (f) 磺胺二甲基嘧啶固体Fig.6 SERS Spectra of sulfamethazine solution with different concentration extracted from fish and Raman spectrum of gold colloid solution and fish. (a) silver colloid, (b) solution extracted from fish, (c, d, e) sulfamethazine solution with different concentration (1 ppm, 5 ppm and 50 ppm) extracted from fish, (f) solid sulfamethazine

图7为鱼肉中磺胺二甲基嘧啶在1 134 cm-1处的特征峰强度与浓度变化关系曲线，由图中可以看出，在低浓度范围内两者呈线性关系，计算得出鱼肉中磺胺二甲基嘧啶的检测限为0.59 ppm。

图7 鱼肉中磺胺二甲基嘧啶的特征峰强度与浓度变化关系曲线Fig.7 Dependence of peak intensity of sulfamethazinein fish on Concentration

由2.2.1讨论可知，磺胺甲基嘧啶相对磺胺二甲基嘧啶固体在1 564 cm-1、1 194 cm-1处出现了明显的拉曼峰。对比图4与图6发现，鱼肉中抗生素浓度为5 ppm时，磺胺甲基嘧啶相对磺胺二甲基嘧啶在1 551 cm-1、1 197 cm-1处依然有明显的拉曼特征峰，可以据此差异区分低浓度时鱼肉中的磺胺甲基嘧啶与磺胺二甲基嘧啶的存在情况。

3 结论

本文通过分析磺胺甲基嘧啶与磺胺二甲基嘧啶固体的分子结构和拉曼光谱，得出了两者分子结构差异对拉曼特征信号的影响。通过对鱼肉中磺胺类抗生素提取方法的研究，确定了最佳提取剂和定容溶剂。结果表明，以银溶胶为基底，乙酸乙酯作为提取剂和定容溶剂，探测到鱼肉中磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的最低浓度均为1 ppm，检测限分别为0.16 ppm和0.59 ppm，在低浓度范围内特征峰强度与浓度呈线性关系。研究表明，SERS技术可以实现鱼肉磺胺类抗生素的检测，为实现水产品中抗生素的快速检测提供了实验基础。

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