生物拆分制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸工艺研究

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(1.浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014；2.浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100)

左乙拉西坦(Levetiracetam,LEV)，化学名(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酰胺，是作用机制独特的新型抗癫痫类药物[1-2]，目前主要通过化学法制备[3].随着LEV市场需求的增加，越来越多该药物的合成方法被报道[4-5].利用生物法制备手性药物及其手性中间体因具有立体选择性高，专一性强，反应条件温和，环境友好等特点而逐渐成为研究热点[6-8].以生物催化法合成LEV或LEV手性羧酸中间体可弥补化学法存在的不足，为研究者提供了新的思路[9].Tao等报道了通过半理性设计(semi-rational design)获得腈水合酶突变体，用于催化外消旋(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙腈不对称合成LEV，产率和ee值分别为43%和94%[10]，但(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙腈的合成过程中需使用高毒性的2-氯丁腈作为原料.

耐酪氨酸冢村氏菌E105菌株系本课题组从土壤中筛选得到.该菌株可选择性催化(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯不对称水解制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸，该手性羧酸经酰胺化后即可制得LEV.笔者所在课题组前期研究中通过对培养基成分筛选和反应条件优化，在10 mL反应体系中实现了(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的生物拆分，产率和ee值分别达45%和99%[11-12].为进一步提高该菌株的催化能力，有必要对其产酶培养条件进行优化，进而提高其应用潜力，进而为LEV的规模化制备提供依据.响应面法可通过对实验数据的拟合建模，分析评价多因素间的交互作用，并预测最优结果，是适合对多变量体系进行评价和优化的快捷有效方法，近年来已有一些通过响应面法对生物反应过程进行优化的报道[13-15].本研究通过单因素实验和响应面优化，得到E105细胞产胞内脂肪酶的最优条件，继而，利用其静息细胞催化(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的生物拆分制备左乙拉西坦关键手性中间体(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸.

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

耐酪氨酸冢村氏菌E105，本课题组从土壤中筛选，并保藏.

种子培养基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏2 g/L，(NH4)2SO42 g/L，K2HPO42 g/L，KH2PO41 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.0.

初始发酵培养基：葡萄糖15 g/L，NH4Cl 9.5 g/L，酵母膏12.1 g/L，K2HPO42 g/L，KH2PO41 g/L，NaCl 0.6 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.0.

1.2 分析方法与酶活力测定

生物拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的反应过程：

α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸产率及ee值参照本课题组报道的HPLC和GC法测定[11,16].

α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸产率为

产率=Cp/Cs×100%

式中：Cp表示产物α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的浓度；Cs表示底物(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的浓度.

(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的光学纯度通过对映体过量值(enantiomeric excess,ee)表征为

t1为烟气在第1区域停留时间（s）；t2为烟气在第2区域停留时间（s）；t3为烟气在第3区域停留时间（s）；t4为烟气在第4区域停留时间（s）；v1为烟气在第1区域平均速度（m/s）；v2为烟气在第2区域平均速度（m/s）；v3为烟气在第3区域平均速度（m/s）；v4为烟气在第4区域平均速度（m/s）。

ee=(AS-AR)/(AS+AR)×100%

式中：AS为S型产物峰面积；AR为R型产物峰面积.

酶活力定义：30 ℃下，每分钟生成1 μmol(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸所需的酶量定义为一个酶活力单位(U).

酶活力测定：称取0.3 g(DCW)菌体，重悬于10 mL磷酸钾缓冲液中，加入30 mmol/L的(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯，30 ℃，200 r/min反应1 h，9 000 r/min离心10 min，除去菌体以终止反应，取上清液检测(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸生成量，计算得到单位重量的菌体酶活力(U/g).

1.3 单因素实验设计

采用初始发酵培养基配方，考察不同装液量(150～350 mL/L)，接种量(2%～6%)和培养时间(24～48 h)对菌体产酶的影响，确定E105菌株最佳的产酶培养条件.

1.4 响应面优化实验设计

运用Design Expert 8.0.6软件设计响应面优化实验方案，考察发酵培养基组成对产酶的影响.

1.4.1 Plackett-Burman(PB)实验

对初始发酵培养基中葡萄糖(A)，酵母膏(B)，氯化铵(C)，磷酸二氢钾-磷酸氢二钾(D)，pH(E)，硫酸铵(F)，氯化钠(G)7个因素和2个虚拟变量(H,I)，进行N=12的9因素PB实验，筛选出对产酶影响显著的因素.

1.4.2 最陡爬坡实验

1.4.3 Box-Behnken(BB)实验

对由PB实验确定的显著因子和最陡爬坡实验确定的中心点，根据Box-Behnken中心组合原理，设计N=17的3因素3水平实验，其中5个为零点重复实验.

1.5 (R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的生物拆分

(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的生物拆分反应在500 mL摇瓶中进行.将培养获得的E105菌体重悬于磷酸钾缓冲液中，摇瓶装液量为300 mL，菌体添加量为30 g/L(DCW)，加入不同浓度的(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯(40～90 mmol/L)，30 ℃，200 r/min反应32 h，以考察不同底物浓度对生物拆分的影响.通过测定产物(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸浓度、产率和ee值，确定拆分反应的最佳底物浓度，并考察在该底物浓度下的生物拆分过程曲线.

2 结果与讨论

2.1 培养条件单因素实验考察

分别考察了装液量，接种量和培养时间对菌体产酶的影响.如图1所示，当摇瓶装液量为300 mL/L，接种量为4%，培养时间为36 h时，酶活力分别达到最大值.当培养时间超过36 h后，菌体增长速度开始减缓，菌体生长进入稳定期.

2.2 Plackett-Burman实验

按照Design Expert 8.0.6软件的设计，对初始发酵培养基中7个因素(葡萄糖，酵母膏，氯化铵，磷酸二氢钾-磷酸氢二钾，pH，硫酸铵，氯化钠)和2个虚拟变量进行N=12的9因素PB实验(表1)，以筛选出对产酶影响显著的因素.由表2可知：A,B,E三因素的P值均小于0.05，是影响菌体产酶的显著因子.因此，选取葡萄糖和酵母膏质量浓度，以及培养基初始pH值三因素进行后续实验.

图1 培养条件对产酶的影响

表1 Plackett-Burman实验设计和响应值

表2 Plackett-Burman实验因素、水平和结果分析

2.3 最陡爬坡实验

根据PB实验结果，对葡萄糖和酵母膏质量浓度，及培养基初始pH进行最陡爬坡实验，3因素的步长选择分别为2.5 g，3 g和0.5，并同步逐渐增大，寻找最优区域.表3结果表明：第3组实验的酶活力最高，为19.03 U/g，表明此时3个变量的取值已经接近最优点附近区域.因此，选择这一组数据作为中心点，进行后续的响应面优化.

表3 最陡爬坡实验设计及结果

2.4 Box-Behnken中心组合实验

如表4所示，以最陡爬坡实验确定的中心点，根据Box-Behnken中心组合原理，设计N=17的3因素3水平实验，其中5个为零点重复实验，并运用Design-Expert 8.0.6对所得数据进行回归分析，得到如下的拟合方程模型：

Y=19.1+0.45X1+0.64X2+0.95X3-0.28X1X2-

0.47X1X3-0.48X2X3-2.71X12-2.07X22-

0.68X32

表5对模型回归系数显著性的检验表明：该模型中每个因子对Y值的影响均高度显著，表明葡萄糖和酵母膏质量浓度与培养基初始pH值三者之间存在明显的交互作用.对该模型进行方差分析，模型P<0.000 1，失拟项P=0.201 6，R2=0.994 5，表明该模型高度显著，拟合度良好，能够用于预测.由图2可知：当pH取值为中心点7.0时，酶活力最大值出现在曲面的中央区域，表明葡萄糖和酵母膏的质量浓度过高或过低，都会影响菌体产酶；而当葡萄糖和酵母膏质量浓度分别位于中心点17.5 g/L和16.0 g/L时，适当提高培养基的初始pH值，有利于产酶.

表4 中心组合实验设计及结果

表5 回归模型系数显著性检验

图2 各因素对菌体产酶的交互影响影响曲面图

2.5 最优条件的实验验证

根据拟合方程，可求得当Y为最大值19.41 U/g时，对应的X1，X2，X3编码值分别为0.079，0.177，0.642.转换为实际值可得到预测结果：葡萄糖17.70 g/L，酵母膏16.53 g/L，pH 7.32.经3次实验验证，实际酶活力为19.33 U/g，较优化前的14.58 U/g提高了32.6%，且实际值接近理论预测值，表明该模型可较好预测E105菌体的实际发酵情况.同时，在最优产酶条件下，E105菌体细胞干重为4.13 g/L，较优化前提高了60.1%.

2.6 (R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的生物拆分

底物浓度是影响生物拆分反应的重要因素之一.为考察经产酶条件优化后制备得到的E105细胞催化(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯不对称水解反应的最佳底物浓度，实验选取40～90 mmol/L的底物浓度进行生物拆分，反应介质为300 mL磷酸钾缓冲液，细胞加量为30 g/L(DCW)，30 ℃，200 r/min反应32 h.由图3可知：当底物浓度为60 mmol/L时，(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸产率达48.5%，ee值为99%.继续提高反应的底物浓度，产率逐渐降低.与产酶条件优化前相比，E105细胞催化拆分的底物浓度可提高至60 mmol/L，较优化前提高了20%，且底物浓度的增加对ee值影响较小.

图3 底物浓度对E105细胞催化生物拆分反应的影响

底物浓度为60 mmol/L时的生物拆分反应过程曲线如图4所示.结果表明：反应24 h后，(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸产率和ee值分别达到48%和99%，最佳拆分反应时间以24 h为宜.

图4 耐酪氨酸冢村氏菌E105细胞生物拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的过程曲线

图5为产酶条件优化前后制备得到的E105细胞催化(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯生物拆分反应结果的比较.结果表明：在优化的产酶条件下制备得到的含酶细胞催化拆分24 h后，产物(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸生成量为8.64 mmol，终浓度达28.8 mmol/L，较优化前提高了32.1%.

图5 产酶条件优化前后制备得到的E105细胞催化生物拆分反应结果的比较

3 结 论

对耐酪氨酸冢村氏菌E105菌株产胞内脂肪酶的产酶条件进行了优化.基于响应面分析，建立了葡萄糖和酵母膏质量浓度，培养基初始pH值三因素对产酶影响的数学模型.经方差分析表明：该模型高度显著，拟合度良好.在优化的产酶条件下，E105菌体的酶活力为19.33 U/g，细胞干重达4.13 g/L，分别较优化前提高了32.6%和60.1%.将培养得到的E105静息细胞用于催化(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的不对称水解，当底物浓度为60 mmol/L时，反应24 h，(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸生成量为8.64 mmol，产率和ee值分别为48%和99%，产物终浓度为28.8 mmol/L，较优化前提高了32.1%，有效提高了耐酪氨酸冢村氏菌E105催化生物拆分反应的效率，为后续研究奠定了较好的基础.

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