基于香豆素与CdTe量子点间的荧光共振能量转移检测超痕量Hg2+的研究

张 霞,韩韵,连盼盼,丁 然,吕鉴泉

(湖北师范学院 化学与环境工程学院， 湖北 黄石 435002)

基于香豆素与CdTe量子点间的荧光共振能量转移检测超痕量Hg2+的研究

张 霞,韩韵,连盼盼,丁 然,吕鉴泉

(湖北师范学院 化学与环境工程学院， 湖北 黄石 435002)

分别合成了3-巯基丙酸稳定的CdTe@SiO2量子点和双臂香豆素金属离子荧光探针前体 (BCP)，并将BCP固定于CdTe@SiO2表面上形成Hg2+探针-CdTe@SiO2@BCP，建立了基于Hg2+对CdTe@SiO2@BCP量子点的荧光猝灭定量检测Hg2+的新方法。考察了pH值等因素的影响。在最佳实验条件下, 可测定5.0×10-8～1.0×10-4mol·L-1的Hg2+, 检出限为6.7×10-9mol·L-1，可应用于实际样品中超痕量Hg2+的测定。

CdTe量子点；香豆素；荧光共振能量转移；Hg2+；CdTe@SiO2@BCP

汞及其化合物是毒理效应最严重的环境污染物[1]，它一旦进入生物体，极易与生物体内蛋白质中的巯基结合形成巯醇盐，在体内某些组织中累积后造成慢性中毒，引起以神经损害为主的多种疾病[2]。因此，汞离子的高灵敏度检测一直是分析化学工作者研究的重要内容[3]。目前，检测汞离子的方法主要有原子荧光光谱法[4]、电化学法[5]、冷原子吸收法[6]、分光光度法[7]、有机染料荧光法[8]等。这些方法具有较高的灵敏度和较好的选择性，通常用于定量分析，但他们不适用于不破坏样品和在生物体内在线检测金属离子，无法清晰的描述Hg2+在细胞内的分布和动态变化，且存在成本高、样品预处理繁琐等不足。

近年来，作为新型荧光探针的量子点(Quantum dots, QDs)，因其优异的光学性能(高选择性、高灵敏度等)和光化学稳定性而颇受关注[9～10]。先后发展了作为荧光探针的CdSe[11]、CdSe/ZnS[12]、CdTe[13]、Ag2S[14]量子点，并应用于汞的高灵敏度检测。

本文采用了反向微乳液法合成了CdTe@SiO2量子点和双臂香豆素金属离子荧光探针前体(BCP)，并将其后者固定于CdTe@SiO2表面上形成Hg2+探针的纳米颗粒(CdTe@SiO2@BCP)。基于Hg2+对香豆素与CdTe量子点间的荧光共振能量转移(FRET)的影响，建立了水溶液中检测痕量Hg2+的新方法。

1 实验部分

1.1仪器与试剂

AL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司), KQ-100DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司), 台式电动离心机(常州国华电器有限公司), DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，S-3400N扫描电子显微镜(日本Hitachi公司)，U-3010紫外-可见分光光度计(日本Hitachi公司)，F-4500 荧光光谱仪(日本Hitachi公司)。

3-巯基丙酸(MPA, 98%), 四乙氧基硅烷(TEOS, 98%)，CdCl2·2.5H2O，7-羟基香豆素购于Alfa Aesar公司，碲粉(国药集团化学试剂有限公司)，3-氨基三乙氧基硅烷 (APTES,97%, 上海盈元化工有限公司)，硼氢化钠(NaBH4, 上海盈元化工有限公司), 1,2-二溴乙烷(EDB, 成都格雷西亚化学技术有限公司)，1,3-丙二硫醇，无水碳酸钾，NaOH等试剂均为国产分析纯, 实验用水为双重蒸馏水。

1.2CdTe@SiO2QDs的合成

CdTe QDs的合成以MPA为稳定剂，Cd∶Te∶MPA的摩尔比为1∶0.5∶2.5，参考文献[15]的方法改进合成CdTe量子点。228.35 mg CdCl2·2.5H2O和14 mL水加入到100 mL三颈烧瓶中，室温搅拌，氮气饱和30 min，迅速加入209 μL MPA。搅拌5 min，滴加1 mol·L-1的NaOH溶液将镉前驱体溶液(Cd2+-MPA)的pH值调节至10,然后迅速加入新制NaHTe溶液，加热至100 ℃ , 氮气保护下继续回流8 h, 得到酒红色溶液。

采用反向微乳液法合成CdTe@SiO2QDs.在100 mL的圆底烧瓶中加入30 mL 环己烷，5 mL 聚乙二醇辛基苯基醚，6.4 mL 正己醇，800 μL 3.22×10-2mol·L-1的碲化镉量子点水溶液，240 μL 6% NH3·H2O混合。经过30 min 的搅拌，添加400 μL TEOS到混合液中，在暗室中继续搅拌24 h，形成了二氧化硅包覆的CdTe QDs.之后，80 μL的APTES和100 μL的TEOS被一起加在到反应容器，搅拌反应12 h，备用。

1.3CdTe@SiO2@BCP的合成

1,9-双(7-香豆素氧基)-3,7-二硫杂壬烷(探针前体, BCP)的合成方法参照文献[16]如图1.向1.2合成的CdTe@SiO2QDs的反应容器中，加入2 mg新合成的1,9-双(7-香豆素氧基)-3,7-二硫杂壬烷，搅拌反应8 h.加40 mL丙酮使产物沉淀，5000 rpm下离心15min，先后用乙醇和水清洗三次，35 ℃下真空干燥，得到CdTe@SiO2@BCP产品。粉末状的产品用于SEM等手段表征。

7-(2-溴乙基氧基)香豆素 IR (KBr) v (cm-1): 3422，1732，1610，1394，1351，1277，1221，1125，999，1013，887，833。BCP IR (KBr) v (cm-1) :3430，2930，1730，1620，1510，1400，1340，1280，1230，1120， 1010，889，837，756.

图1 1,9-双(7-香豆素氧基)-3,7-二硫杂壬烷(探针前体probe precursor, BCP)的合成简图

1.4实验方法

光谱测试所用CdTe@SiO2@BCP浓度为50 mg·L-1.即取0.5 mg纯化干燥的CdTe@SiO2@BCP在10 mL的比色管中，加2 mL PBS (0.1 mol·L-1)缓冲溶液，再加入定量的汞标准溶液或者实际样品，用蒸馏水稀释到刻度，放置一段时间，测定其荧光强度。荧光的测试条件设置参数为：激发波长330 nm，激发、发射狭缝宽度均为10 nm，电压为700V.

2 结果与讨论

2.1CdTe@SiO2@BCP的合成

CdTe@SiO2@BCP参照文献[17]合成，如图2所示。不同的是，以MPA为稳定剂，在加入MPA搅拌5 min后，将镉前驱体溶液的pH值调节至10，迅速加入新制NaHTe溶液，加热至100 ℃.10 min后，加入400 μL TEOS，氮气保护下回流8h，得到酒红色溶液，用无水乙醇纯化离心，置于恒温箱中干燥保存。之后，80 μL APTES和100 μL TEOS被加到反应容器，暗室中搅拌反应12 h.

图2 CdTe@SiO2@BCP的合成简图

CdTe@SiO2QDs外形成了一个带正电间隔层。研究表明Hg2+小到可以渗入凝胶状的CdTe@SiO2量子点里，非常容易使硅烷化量子点的荧光猝灭。在本研究中，为了解决这个问题，我们设计在硅烷化的量子点表面形成一个正电荷超薄间隔层。从图3(A)中我们可以看到，没有加入APTES和TEOS形成保护隔层的CdTe@SiO2QDs，在Hg2+浓度仅为9.0×10-8mol·L-1时所合成的CdTe@SiO2@BCP的荧光发射几乎完全熄灭。然而如图3(B)，由APTES和TEOS形成的带电的保护隔层的CdTe@SiO2QDs所合成的CdTe@SiO2@BCP其在加入相同浓度的Hg2+的荧光只产成了非常轻微的猝灭。因此，推测加入APTES和TEOS使得CdTe@SiO2QDs外形成了带正电的间隔层。我们假设带正电的间隔层可以通过库仑斥力防止阳离子(Hg2+)进入CdTe@SiO2量子点里。那么，当一定浓度的Hg2+与CdTe@SiO2@BCP作用后其荧光不熄灭，则说明CdTe@SiO2QDs存在带电间隔层。

图3 Hg2+对无带正电的间隔层(A)和有带正电的间隔层(B)的CdTe@SiO2 QDs合成的CdTe@SiO2@BCP的荧光光谱的影响

2.2CdTe@SiO2@BCP的表征

分别用扫描电子显微镜、紫外-可见光谱、荧光光谱等对CdTe@SiO2@BCP进行了表征。

用扫描电子显微镜(SEM)观察量子点的形貌，结果如图4所示。从图中可以看出，CdTe@SiO2@BCP的形貌呈类球形, 粒径分布较均匀，结构致密, 分散性好。

图4 CdTe@SiO2@BCP的扫描电子显微镜(SEM)图

从图5紫外-可见吸收光谱(a)和荧光发射光谱(b)可见，CdTe@SiO2@BCP在210 nm和330nm处分别有一个明显的和一个微小的吸收峰(曲线a)。以330 nm作为CdTe@SiO2@BCP的激发波长，在578 nm处得到其荧光发射峰(曲线b)，半峰宽为55 nm，说明该量子点的光学性能优良。

2.3pH值对检测汞离子的影响

工作中，考察了在不同pH值的(0.1 mol·L-1PBS, 5.0～9.0)缓冲溶液中CdTe@SiO2@BCP与Hg2+作用前后荧光强度的变化。从图6 中可见, 随着pH值的增加，CdTe@SiO2@BCP的荧光强度先增后减。这可能是因为当溶液呈弱酸性时，溶液中的H+多于OH-，带正电的间隔层可以通过库仑斥力防止阳离子(如H+)进入CdTe@SiO2量子点里，从而减少了CdTe@SiO2@BCP量子点表面的无辐射结合位点，从而使其表面的缺陷减少，致使量子点的荧光强度增强。当溶液呈弱碱性时，溶液中的OH-多于H+，带正电的间隔层可以结合更多的阴离子(如OH-)进入CdTe@SiO2量子点里, 从而增加了CdTe@SiO2@BCP量子点表面的无辐射结合位点，从而使其表面的缺陷增多，致使量子点的荧光强度减弱。当pH=7.0时，溶液呈中性，CdTe@SiO2@BCP量子点的荧光强度最大。比较加入Hg2+前后，两条曲线变化趋势大致相同，不同的是在加入Hg2+后与量子点表面基团作用，造成量子点聚集，导致在不同pH值条件下荧光强度均有减弱。对比两条曲线，在pH=7.0条件下荧光强度最大。

图5 CdTe@SiO2@BCP的紫外-可见吸收(a)荧光发射(b)光谱图(CQDs=50 mg·L-1 , 0.1 mol·L-1 pH 7.0 PBS)

图6 CdTe@SiO2@BCP在不同pH值中的荧光强度

图7 pH值对体系荧光猝灭的影响

表面键合巯基、羧基的质子化都可能导致CdTe@SiO2@BCP表面的重组，因此水相合成的CdTe@SiO2@BCP的性质与pH值的变化可能紧密相关。故，研究中分别考察了在不同pH值的PBS缓冲溶液中Hg2+对CdTe@SiO2@BCP的荧光猝灭的影响。从图7 中可见，在不同的pH值下9.0×10-5mol·L-1Hg2+对CdTe@SiO2@BCP荧光的猝灭程度呈现规律性变化，其中以pH 7.0下的荧光差最大，因此，选取pH=7.0的PBS缓冲溶液作为实验的测试条件。

2.4分析性能

我们在优选的实验条件下，对CdTe@SiO2@BCP进行了荧光光谱研究，结果如图8所示。从图(A)可见，随着Hg2+离子浓度[Q]的增加(cHg2+(A→N): 0, 5.0×10-9, 5.0×10-8, 5.0×10-7, 5.0×10-6, 6.0×10-6, 7.0×10-6, 8.0×10-6, 9.0×10-6, 1.0×10-5, 2.0×10-5, 3.0×10-5, 4.0×10-5, 5.0×10-5mol·L-1)，CdTe@SiO2@BCP量子点的荧光峰位基本不变而荧光强度逐渐降低。从图(B)可见，F0/F与[Q]在1.0×10-5～9.0×10-5mol·L-1间存在良好的线性关系(F与F0分别为Hg2+存在和不存在时的荧光强度)。线性方程为F0/F=1.32+0.0085[Q]，相关系数R=0.9932，检测限(空白值的3倍标准偏差)为6.7×10-9mol·L-1.在优选的实验条件下，重复6次测量9×10-5mol/L的Hg2+，其相对标准偏差RSD=0.003%.

图8 CdTe@SiO2@BCP 对汞离子的检测(cQDs=50 mg·L-1)(B)中cHg2+: 0, 5.0×10-8, 1.0×10-7, 5.0×10-7, 1.0×10-6,2.0×10-6……9.0×10-5,1.0×10-4 mol·L-1

在荧光光谱研究的基础上，我们在优选的实验条件下对CdTe@SiO2@BCP进行了紫外-可见光谱的研究，从图9可见，随着Hg2+浓度的增加(加cHg2+:0, 6.0×10-5, 1.2×10-4, 1.8×10-4, 2.4×10-4…..9.6×10-4mol·L-1)，CdTe@SiO2@BCP的紫外吸收光谱的强度先略微降低后大幅升高。当加入低浓度的Hg2+时，CdTe@SiO2@BCP表面的BCP只部分络合，从而增加了BCP的荧光团分子间的空间位阻，使得CdTe@SiO2@BCP的紫外吸收光谱的强度先略微降低；当加入的Hg2+浓度越来越大时， Hg2+的络合使得与BCP相连的O原子和S原子的电子云密度降低，供电子效应减弱，使得BCP的荧光团分子的电子云极化和偏转程度减小，从而导致CdTe@SiO2@BCP的紫外吸收光谱的强度大幅升高。

图9 CdTe@SiO2@BCP的紫外吸收光谱随Hg2+的浓度的变化

图10 不同金属离子对CdTe@SiO2@BCP荧光猝灭的影响

2.5干扰实验

本实验选择一些常见的共存物质进行干扰分析实验，主要选取了浓度为9×10-5mol·L-1的Na+、K+、Ba2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Pb2+、Mn2+、Ni2+、Al3+、Fe3+、Hg2+等13种金属离子分别与等浓度的CdTe@SiO2@BCP溶液混合，考察CdTe@SiO2@BCP荧光强度的变化，如图10所示。结果表明，大多数共存离子对于CdTe@SiO2@BCP量子点测定汞基本上没有干扰。但是，与其他金属离子相比较，Hg2+与CdTe@SiO2@BCP作用最为明显，其荧光猝灭程度最大，说明CdTe@SiO2@BCP量子点对Hg2+有良好的选择性。

2.6CdTe@SiO2@BCP与Hg2+的作用机理

可以推测，由于BCP修饰的CdTe@SiO2@BCP其表面富含O原子和S原子，带正电荷的Hg2+在两个O原子与两个S原子所构成的"空腔"中与它们配位作用后电荷转移，使得香豆素荧光团(BCP)的电子云密度降低，形成CdTe@SiO2@BCP表面电子缺失从而导致CdTe@SiO2@BCP的荧光猝灭，CdTe@SiO2@BCP与Hg2+的作用方式如图11(A)所示。当BCP被激发以后就会和CdTe@SiO2QDs形成电子能量转移，即CdTe@SiO2@BCP和Hg2+形成复合物后，两个发色团之间的距离被缩短，从而发生了BCP与CdTe@SiO2QDs间的电子能量转移。CdTe@SiO2QDs存在带电间隔层，CdTe量子点作为能量供体被限制在特定的二氧化硅网中，避免了CdTe量子点和带正电的Hg2+之间的联系(Hg2+与带正电的间隔层存在静电排斥)，可以将能量转移到1,9-双(7-香豆素氧基)-3,7-二硫杂壬烷(探针前体, BCP)-能量受体，因此得以实现荧光共振能量转移(FRET)在水溶液中对痕量Hg2+快速、灵敏、选择性好的识别和检测。

图11 (A) CdTe@SiO2@BCP与 Hg2+可能的作用机理;(B)紫外灯下加入Hg2+前后CdTe@SiO2@BCP的变化

3 实际样品的分析

按照《水和废水监测分析方法》中的样品处理办法，预先采集水样，然后经过静置、离心处理后，取上层清液1 mL 按文中方法测定其中的Hg2+浓度。分别应用于矿泉水、湖水、自来水中Hg2+的测定, 数据列于表1。矿泉水、自来水中没有检测到Hg2+，当地湖水中Hg2+的含量为4.5×10-7mol·L-1(青山湖湖水)、1.6×10-8mol·L-1(磁湖湖水)。并进行加标回收实验，其回收率在96.2～110%之间。结果表明，本方法可应用于实际样品中超痕量Hg2+的分析检测。

表1 实际水样中Hg2+含量的测定和方法的回收率

4 结论

本文采用MPA作为CdTe量子点的稳定剂，通过硅烷化，形成了带正电的间隔超薄层的CdTe@SiO2量子点，然后在其表面沉淀一层新合成的双臂香豆素金属离子荧光探针前体(BCP)，形成具有良好水溶性和荧光性能的CdTe@SiO2@BCP，构建量子点与香豆素衍生物之间的荧光共振能量转移体系, 利用Hg2+对CdTe@SiO2@BCP量子点的荧光选择性的猝灭，建立了高灵敏度检测水溶液中的Hg2+的新方法，并成功地应用于实际水样的分析检测。本方法具有操作简单、快速、灵敏度高和选择性好等特点。

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DetectionofultratraceHg(Ⅱ)basedonfluorescenceresonanceenergytransferbetweencoumarinandCdTequantumdots

ZHANG Xia, HAN Yun, LIAN Pan-pan, DING Ran, LV Jian-quan

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hubei Normal University, Huangshi 435002, China)

CdTe@SiO2quantum dots and bis-hydroxycoumarin fluorescent probe precursor (BCP) metal ions were respectively synthesized. A novel mercury ions fluorescent probe CdTe@SiO2@BCP was formed by the fixing of BCP on the CdTe@SiO2QDs surface. A sensitive and selective detection of Hg2+has been developed based on fluorescence resonance energy transfer (FRET) between coumarin and CdTe quantum dots in CdTe@SiO2@BCP quantum dots. Influence of pH on the fluorescence was investigated. Under the optimum conditions, the calibration graph was linear in the range of 5.0×10-8～1.0×10-4mol/L of Hg2+with the detection limit of 6.7×10-9mol/L. And the method has been successfully applied to the determination of trace concentrations of mercury ions in actual water sample.

CdTe QDs；coumarin；fluorescence resonance energy transfer (FRET)；mercury ion；CdTe@SiO2@BCP

2013—11—06

湖北省自然科学基金(2010CDA061);湖北省教育厅创新团队项目和重点项目(D200922005);污染物分析与资源化技术湖北省重点实验室开放基金(KY2010M03)资助.

张 霞(1984— )，女，湖北黄冈人，硕士研究生.

O657.3

A

1009-2714(2014)01- 0030- 07

10.3969/j.issn.1009-2714.2014.01.007