大面积脑梗死患者血清let-7f表达的初步研究

龚 哲 赵绍云 张 静 徐小隔 何 霞 邓文静 牛瑞娜 滕军放 贾延劼

1)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052 2)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052

大面积脑梗死患者血清let-7f表达的初步研究

龚 哲1，2)赵绍云1，2)张 静1，2)徐小隔1，2)何 霞1)邓文静1)牛瑞娜1)滕军放1)贾延劼1)

1)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052 2)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052

目的 本研究拟初步探讨let-7f与大面积脑梗死的诊断及发展的相关性。方法 采用前瞻性队列研究方法，收集神经重症ICU的缺血性脑卒中患者血标本(128例)，并收集年龄、性别匹配的正常人群、脑出血患者作为对照。将血清标本进行miRNA提取、反转录及实时荧光定量PCR，以检测血清中let-7f的相对表达量。结果 血清let-7f在大面积前循环脑梗死患者中表达较正常人群显著下调(P<0.05)；在后循环脑梗死患者中的表达水平较正常人群无显著性差异。血清let-7f在大面积脑梗死合并出血转化患者中表达较正常人群显著上调(P<0.05)，但较脑出血患者无显著性差异。血清let-7f在脑出血患者中的表达水平较正常人群显著上调(P<0.05)。血清let-7f在非大面积脑梗死患者中的表达水平较正常人群显著上调(P<0.05)，但低于脑出血患者。血清let-7f表达水平与肺部感染无显著性差异(P>0.05)。血清let-7f与脑出血或脑梗死合并出血呈高度正相关性，其次与梗死面积呈负相关。结论 血清let-7f表达水平对于大面积前循环脑梗死的诊断及发展具有一定的相关性。

let-7f；大面积脑梗死；脑出血

大面积脑梗死是脑梗死中较严重的类型，是指脑主干动脉狭窄、闭塞导致相应供血区域脑组织的梗死，约占脑梗死的10%，以发病突然、进展快为特点，并常出现颅高压、意识障碍，通常病情危重。然而，目前临床上用于诊断及评价大面积脑梗死预后的方法多局限在影像学，缺乏相应的新的生物学指标。microRNA是一种微小的非编码RNA，被认为用于调节基因表达的内在生物因子，也因在某些病理生理过程中起到重要作用而被大家认识，如肿瘤发生、增殖作用、造血作用、代谢作用、炎症反应、胚胎生成及神经退行性疾病等。同时，microRNA也被发现在淋巴瘤病因学及一些神经系统疾病的诊断方面具有重要意义。其中let-7f因在肿瘤[1]、免疫性疾病[2-4]及神经退行性疾病[5-7]中的表达具有特异性改变而受到关注。本研究拟初步探讨let-7f与大面积脑梗死的诊断及发展的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采用前瞻性队列研究方法，连续收集2013-07—2014-06入神经重症ICU的缺血性脑卒中患者128例，男73例，女55例；年龄35～86岁，平均60岁，其中30～40岁 15例，>40～50岁 28例，>50～60岁 39例，>60～70岁 36例，70岁以上 10例。按照牛津郡社区卒中规划(OCSP)分型，完全前循环梗死57例，部分前循环梗死26例，后循环梗死34例，腔隙性梗死11例。根据收集标本时患者的病情进行mRS评分，完全前循环梗死患者(55例)均mRS≥4，部分前循环梗死患者15例mRS≥4，后循环梗死患者20例mRS≥4，余患者mRS<3。

根据影像学将脑梗死面积直径>4.0 cm或梗死灶波及2个脑叶以上者归为大面积脑梗死组(88例)，即A组，其中前循环梗死患者归为A1组(63例)，后循环梗死患者归为A2组(25组)，非大面积脑梗死归为B组(40例)，根据是否合并出血或肺部感染进行再分组。同时收集年龄、性别匹配的正常人群45例，脑出血患者20例作为对照(见表1)。

表1 患者一般资料比较

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂：miRNA提取分离试剂盒购自北京康为公司，Reverse Transcriprition System(A3500)、Gotaq qPCR Master Mix(A6001)购自Promega公司，let-7f引物购自广州锐博生物科技有限公司。

1.2.2 血清标本的收集：抽取患者外周血，收集于无抗凝剂管中，于4℃ 592.5×g 离心15 min，提取上层血清于EP管中置于-80℃冰箱备用。

1.2.3 血清micro RNA的提取：按照miRNA提取分离试剂盒(北京康为公司)说明书提取血清中micro RNAs。

1.2.4 RT-PCR：根据Reverse Transcription System说明书，将miRNA逆转录为cDNA。按照Gotaq qPCR Master Mix说明书进行荧光定量检测，以5S为内参。记录相应的Ct值，miRNA相对表达量采用公式2-△△Ct方法计算，所有样本重复3次，整个实验采用盲法。根据大面积脑梗死患者的miRNA表达水平回顾性队列研究大面积脑梗死患者的预后情况，登记生存时间。

2 结果

2.1 患者一般资料 实时定量PCR的大面积脑梗死组、非大面积脑梗死组、脑出血组、正常对照组(见表2)，各组间年龄、性别差异无统计学意义。

表2 患者一般资料比较

注：年龄与实验组比较，*#△P>0.05；性别比例与实验组比较，*#△P>0.05

2.2 血清中let-7f在各实验组及对照组中的相对表达量及相关性 结果显示(见图1)：血清let-7f在大面积前循环脑梗死患者中表达较正常人群、脑出血患者显著下调(P<0.05)；在后循环脑梗死患者中的表达水平较正常健康人群无显著性差异，与前循环脑梗死、脑出血患者有显著性差异(P<0.05)。同时，血清let-7f在大面积脑梗死合并出血转化患者中表达较正常人群、非出血大面积脑梗死患者显著上调(P<0.05)，但较脑出血患者无显著性差异。血清let-7f在脑出血患者中的表达水平较正常健康人群、大面积脑梗死、非大面积脑梗死患者显著上调(P<0.05)。血清let-7f在非大面积脑梗死患者中的表达水平较正常健康人群、大面积脑梗死患者显著上调(P<0.05)，但低于脑出血患者。血清let-7f表达水平与是否肺部感染无显著性差异(P>0.05)。血清let-7f与脑出血或脑梗死合并出血呈高度正相关性，其次与梗死面积呈负相关(见表3)。

注：a表示大面积前循环脑梗死，a’表示大面积后循环脑梗死，b表示非大面积脑梗死，c表示脑出血或合并出血，d表示合并肺部感染，NC表示正常健康组。1组表示单纯大面积前循环脑梗死组，2组表示大面积前循环脑梗死合并脑出血组，3组表示大面积前循环脑梗死合并肺部感染组，4组表示大面积前循环脑梗死合并脑出血及肺部感染组，5组表示单纯大面积后循环脑梗死组，6组表示大面积后循环脑梗死合并脑出血组，7组表示大面积后循环脑梗死合并肺部感染组，8组表示大面积后循环脑梗死合并脑出血及肺部感染组，9组表示单纯非大面积脑梗死组，10组表示非大面积脑梗死合并脑出血组，11组表示非大面积脑梗死合并肺部感染组，12组表示非大面积脑梗死合并脑出血及肺部感染组，13组表示单纯脑出血组，14组表示脑出血合并肺部感染组

图1 血清中let-7f在各实验组及对照组中的相对表达量比较

表3 血清中let-7f与各类相关因素的相关性

3 讨论

大面积脑梗死是脑梗死中较严重的类型，病情凶险，病死率和致残率均很高。定义目前尚无统一明确的标准，有人认为脑梗死面积直径>4.0 cm或梗死面波及2个脑叶以上者,也有人称脑梗死波及范围大于同侧1/2或2/3的面积[8]。我们采用了前者，即梗死面积直径>4.0 cm或梗死面波及2个脑叶以上的标准。

本研究发现，血清let-7f在大面积前循环脑梗死患者中表达较正常人群显著下调，其mRS多≥4分，可鉴别于其他脑血管疾病，如脑出血及非小面积脑梗死，且脑梗死后出血性转化患者中let-7f的表达水平与脑出血患者表达水平无明显差异，较正常人水平上调，因此，检测血清let-7的表达水平对于诊断大面积前循环脑梗死及是否合并出血性转化的疾病发展过程亦有诊断意义，考虑与炎症反应、血管再生、内皮细胞增殖及神经保护作用等有关。

研究发现，let-7f与炎症反应有关，其水平与Blimp-q的表达有一定相关性。Blimp-1对IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-6等促炎因子的抑制作用[9-10]，而敲除let-7f基因可导致Blimp-1表达增加，let-7f的过表达可抑制Blimp-1的表达，故let-7f可提高促炎因子的释放。然而，在大面积脑梗死患者发病后数小时至数天内，其活化的T淋巴细胞减少且外周免疫器官会处于“脑梗死后免疫缺陷状态”[11]，可考虑let-7f表达水平的下降与此相关。

Let-7f与组织血管再生及血管内皮细胞增殖有一定相关性。研究发现，在青年卒中患者中，血清let-7f与脑梗死后血管内皮增殖及血管再生有关，且在恶性肿瘤中，let-7f可促进肿瘤组织中血管生成[12-14]。而大面积脑梗死患者发病多与房颤等冠心病有关，Yamanouchi等[15-16]报道了3408例65岁以上的连续老年尸检材料，在132例大面积脑梗死病例中，86例由心源性脑梗死引起，只有34例为血栓形成或其他梗死原因引起，即大面积脑梗死患者多为颈内动脉或大脑中动脉急性闭塞，或在原有血管狭窄的基础上急性闭塞，颅内血管再生过程尚未发生。

Let-7f的下游基因众多，其中包括很多与脑梗死相关的基因，如AMOT(血管动蛋白)、IGF、ESM1、VPS26B等。研究表明，绝经后女性的let-7f水平升高，IGF-1水平降低[17]，应用let-7f拮抗剂后可有效升高IGF-1水平，提高脑梗死后神经保护作用[18]，可考虑在非大面积脑梗死患者中应用let-7f拮抗剂可能改善脑梗死预后。

目前大面积前循环脑梗死患者血清中let-7f表达水平改变的机制尚不完全明确，但根据本研究结果，let-7f的表达水平改变对于诊断大面积前循环脑梗死及是否合并出血性转化的疾病发展过程具有诊断意义，有望成为其新的生物学标记物。

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(收稿2014-05-20)

The primary research of let-7f’s expression in serum in large area cerebral infarction

GongZhe＊,ZhaoShaoyun,ZhangJing,XuXiaoge,HeXia,DengWenjing,NiuRuina，TengJunfang,JiaYanjie

＊DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China

Objective To investigate the correlation between the expression of let-7f in serum and the diagnosis and the development of large area cerebral infarction.Methods Prospective cohort study was used to collect the ischemic stroke patients blood samples (128 cases) in neurological ICU, and the serum of normal people and cerebral hemorrhage patients whose age and sex were matched.The relative expression of let-7f in plasma was checked by managing the serum samples by miRNA extraction, reverse transcription and quantitative real-time PCR.Results The expression of let-7f in patients of pre-cycle massive cerebral infarction was significantly lower than normal population (P<0.05); the expression of let-7f in pro-cycle massive cerebral infarction patients had no significant difference compared with the normal population.The expression of let-7f in patients of hemorrhagic infarction patients was significantly higher than the normal population(P<0.05), which had no difference compared with encephalorrhagia.The expression of let-7f in patients of encephalorrhagia was significantly higher than normal population (P<0.05).The expression of let-7f in non-massive cerebral infarction patients was significantly higher than the normal population(P<0.05), which was lower than the patients of encephalorrhagia.The expression of let-7f had no significant correlation(P>0.05).The expression of let-7f in serum had a highly positive correlation compared with hemorrhagic infarction and encephalorrhagia, and was negatively correlated with the infarct area.Conclusion The expression of let-7f in serum is meaning for the diagnosis and the development of large area cerebral infarction.

let-7f; Large area cerebral infarction; Encephalorrhagia

国家自然科学基金(编号：81371385)

R743.33

A

1673-5110(2014)23-0008-03