季铵盐类农药残留检测前处理研究

张庆庆，王燕燕，孟品佳

（1.中国人民公安大学刑事科学技术系，北京100038；2.北京市公安局法医鉴定中心，北京100192）

0 引言

常见的季铵盐类农药有百草枯（Paraquat，PQ）、敌草快（Diquat，DQ）、燕麦枯（Difenzoquat，DF）及植物生长调节剂矮壮素（Chlormequat，CQ）和甲哌啶（Mepiquat，MQ），均属强碱性极性阳离子有机化合物（结构见图1），易溶于水、挥发性低、在酸性和中性条件下稳定.其中，百草枯在pH＞12时水解，敌草快在pH＞9时缓慢降解，燕麦枯、甲哌啶和矮壮素具有不易生物降解和水解的特性（理化性质见表1［1］），液液萃取（LLE）方式较难实现对痕量残留的分离、净化和富集，固相萃取作为一种有效的前处理技术近年来广泛的应用于季铵盐检测中.

图1 季铵盐类农药分子结构式

表1 季铵盐农药的理化性质

1 固相萃取吸附剂

目前用于季铵盐类农药检测的固相萃取吸附剂主要有以下3类：

1.1 键合硅胶吸附剂 键合硅胶上未封端硅羟基在pH＞2时带负电荷，与极性组分间存在偶极-偶极作用、离子相互作用及氢键作用，易与季铵盐类化合物发生不可逆吸附作用.Vidal［2］、Ibáñez［3］和Gill［4］使用硅胶和C18柱时，通过添加十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）来减少因吸附而造成的损失.王瑞花［5］稍作改进后使尿液、血液、肝脏样品中百草枯的提取率增加至83%.刘菲［6］用碱性CTAB处理C18柱，并用碱性己烷磺酸钠离子试剂富集蔬菜中的百草枯，检出限达10ng／mL.成美容［7］处理茶叶这类含有多种茶多酚和生物碱等干扰成分的检材时，在弱碱性溶液中用CTAB修饰C18，碱性环境避免了生物碱形成阳离子与百草枯竞争吸附点.由于键合硅胶类吸附剂的稳定性受到样品pH值的限制，正逐渐被其它更耐酸碱的吸附剂所替代.

1.2 有机聚合物吸附剂 相较于硅胶基质，聚合物树脂型吸附剂更耐酸碱，具有不受无机盐等低分子化合物的影响；没有活性羟基的次级吸附作用；不存在上样前柱子干涸而产生对柱效的影响；具有比键和硅胶更高的保留容量等优点.季铵盐类化合物性质适用于离子交换模式萃取，常见的树脂型离子交换柱是以聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）为基质的萃取柱，Castro［8］比较了Hysphere-C8EC（辛基硅胶）、PLRP-S（聚合物）、Hysphere-Resin GP（聚苯乙烯）、Hysphere-Resin SH（聚苯乙烯和二乙烯基苯）、Hysphere-C18HD EC（键合十八烷基硅胶）等固相柱，结果显示矮壮素、甲哌啶和敌草快在使用C8和C18柱时回收率都很低，敌草快在使用C18柱时几乎没有回收，而使用树脂型柱时均能取得较好的回收率.张婷［9］用国产732阳离子树脂提取尿液和血样中的百草枯也取得了不错的结果.而近年来出现了由亲脂性二乙烯基苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体共聚的亲水-亲脂两亲平衡型吸附剂，如Strata-X-CW［10］和Oasis WCX［11］，是以聚合物为基质的弱阳离子交换和反相双重机理混合型萃取材料，这种水可浸润型吸附剂对极性和非极性化合物均有保留能力，能同时保留酸性、中性、碱性分析物.Yong［11］用Oasis WCX柱提取河水中的百草枯和敌草快，相对回收率达到95%～109%，接着李红梅［12］在Yong的基础上引入离子液体优化了实验.

1.3 碳基吸附剂等 碳基吸附剂（活性炭，石墨化炭黑，多孔石墨化碳，碳纳米管）对极性和非极性样品中的极性和非极性有机化合物均有较高的吸附力，有较大的极性适用范围，但会对某些化合物产生不可逆吸附.Nu′nñez［13］用多孔石墨化炭黑富集水中三种季铵盐除草剂，燕麦枯的回收率是80%，而百草枯和敌草快的回收率仅为40%，可能是与吸附剂间发生了不可逆吸附的原因.赵永信［14］比较SCX（强阳离子交换型反相键合硅胶）、MCX（混合阳离子型聚合物）、硅胶、CARB（碳基吸附剂）、CARB／NH2（碳／氨丙基）、CARB／PSA（碳／乙二胺-N-丙基）等萃取柱，发现这些萃取柱对季铵盐的吸附力均很强，纯有机溶剂难洗脱，水溶液虽洗脱容易，但不利于后续衍生化气相色谱分析.后采用国产中性氧化铝萃取柱时，发现净化液干扰少，回收率85%以上.多壁碳纳米管是一种新型的碳纳米材料，Zhou［15］用N掺杂TiO2纳米管富集水样中的百草枯和敌草快，检出限分别为1.95μg／L，2.59μg／L，表明碳纳米管也具有较好的富集能力，但其在固相萃取的应用还在研究阶段.

2 待测物洗脱

水相中键合硅胶表面硅羟基的次级作用较强，须调节pH值来削弱次级吸附（低pH值可中和硅羟基），如硅胶类用酸性甲醇溶液［2］洗脱；氧化铝仅用甲醇［14］就可以洗脱；石墨化炭黑和树脂等用甲醇、乙腈、三氟乙酸、水等混合溶液［11，13］来洗脱.在洗脱液中加入反离子，如氨改性剂（二乙胺或三乙胺等）与待测化合物的氨基竞争表面硅羟基，以减弱待测物与吸附剂的次级吸附，以便待测物尽快洗脱.如以磷酸为基质的二乙胺［6］，甲醇-甲酸铵［16］等洗脱液.季铵盐类农药属于阳离子化合物，适宜选用弱阳离子交换柱.萃取时应注意样品pH值须让目标化合物和吸附剂带相反的电荷，而水相中季铵盐在pH值1～14范围内几乎都以离子形式存在，因此洗脱时应主要考虑柱上键合离子的状态.弱阳离子交换柱上键合的羧基官能团pKa值约在4.8左右，当调节样品pH值大其2个单位时，吸附剂表面带负电荷，能吸附分离季铵盐类阳离子.清洗时注意使用同样pH值的缓冲液，而洗脱时用低于羧基弱阳离子pKa值至少2个单位值的混合溶剂，使吸附剂的羧基转变为中性洗脱［10-11］.

3 固相萃取应用

3.1 液体样品 环境水样［2，11，13，15］固体颗粒含量高时需过滤［2，15］.饮用水中有害物质浓度很低，大量通过萃取柱时会使已预处理好的柱表面伸展开的碳链萎缩，萃取效能降低，可考虑加1%～5%的水溶性甲醇或异丙醇等有机溶剂［17］改善.有时考虑不过滤样品，让样品直接通过萃取装置，洗脱时，让溶剂通过吸附剂上的颗粒以提高回收率.酒精含量高时，需用水或缓冲溶液稀释至酒精含量小于10%.果汁一般离心取上层溶液即可，粘性大的可能需用水或适当的pH值缓冲溶液稀释［16］.脂肪和油类可用正己烷、二氯甲烷等非极性有机溶剂溶解后处理［18］.现将国内外对于水样中季铵盐的固相萃取法归结为表2.

表2 水样中季铵盐类农药固相萃取方法

续表2

3.2 生物样品 血清与血浆常用缓冲溶液稀释后离心，或用乙腈［19-21］、甲醇或丙酮沉淀蛋白质，离心后移取上层清液，用水或缓冲溶液稀释后萃取.也可用酸或无机盐，如甲酸、高氯酸［22］、三氯乙酸（TCA）［23］、偏磷酸和硫酸铵等脱蛋白.对生物组织的酸分解和脱蛋白，常用硫酸［24］、高氯酸［25］等.此外，酶水解来释放化合物或药物［5］效果会更好，但操作繁琐.尿液含有大量盐，有时须用水或者缓冲溶液稀释至少一倍.现将国内外对于生物样本中季铵盐农药固相萃取法归结为表3.

表3 生物样品中季铵盐类农药固相萃取方法

3.3 土壤、植物等样品 蔬果及农产品研磨后加极性溶剂，如乙腈［26］、甲醇-甲酸（盐酸）［6-7，27］、甲醇-乙腈［14］、甲醇-甲酸铵［16］和甲醇-乙酸铵［28］等均质化，离心或过滤除去沉淀固体后调节pH值萃取.传统的索氏萃取法效率高但耗时长，其他的技术如超声波萃取［28］、加速溶剂萃取［29］、微波辅助萃取［30］、超临界萃取［18］等能通过外加能量提高萃取效能，萃取成分也比常规的复杂，需进一步萃取净化.某些专业的萃取仪器萃取效能虽高但价格昂贵难以普及，如Marchese［29］使用Dionex ASE200加速溶剂自动化连续萃取系统，检测面粉和婴儿食品中的甲哌啶和矮壮素，检测限能达到纳克级.现将国内外对果蔬等食品中季铵盐的固相萃取法归结为表4.

表4 果蔬等食品样品中的季铵盐类农药固相萃取方法

4 结论与展望

固相萃取法操作简便、快速、回收率高，重现性好，适合提取微量样品.目前，固相萃取材料侧重于开发混合型吸附剂，能综合运用氢键、极性、非极性以及离子相互作用等多种作用力，适用范围广，通用性更强，能用于各种化合物的萃取分离.近来常用于季铵盐类的固相萃取柱主要包括弱阳离子交换柱（如Oasis WCX柱、Strata-X-CW柱等）、一般型萃取柱（C18柱、氰基柱等）以及碳纳米管等.而以上这些都存在选择性不够强，对提纯液净化不够完全等问题.农药残留痕量物质分析中，因基质的多样性、待测组分含量低，选择性分离分析成为前处理的研究热点.因此固相萃取研发的一个重要方向就是开发具有高度特异性的选择型吸附剂，如免疫萃取吸附剂和分子印迹聚合物吸附剂.这些吸附剂都具有特异性和选择性的优势，萃取、浓缩、分离可一步完成，能有效地降低基质的干扰，高度选择性的分离分析实际样品中残留的农药分子.但免疫萃取吸附剂目前存在抗体的种类不多，尤其是小分子化合物的抗体制备技术难度较大，制作成本高，难以得到推广.分子印迹聚合物吸附剂是近年来出现的另一种新型的选择性萃取剂，目前仍处于实验室的研制阶段，这两种选择性吸附剂在季铵盐类农药检测方面的研究与应用不多，本文中不做论述.由此可见，不断改进的固相萃取新材料将进一步的优化实验方法，具备高度特异性的选择性吸附剂未来具有非常广阔的应用前景，固相萃取仍将是未来几年前处理的主流方法.

［1］PicóY，Font G，MoltóJ C，et al.Solid-phase extraction of quaternary ammonium herbicides［J］.J Chromatogr A，2000，885（1／2）：251-271.

［2］Vidal J L，Vega A B，López F J，et al.Application of internal quality control to the analysis of quaternary ammonium compounds in surface and groundwater from Andalusia（Spain）by liquid chromatography with mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2004，1050（2）：179-184.

［3］Ibáñez M，PicóY，Mañes J.Improving the solid-phase extraction of“quat”pesticides from water samples Removal of interferences［J］.J Chromatogr A，1998，823（1／2）：137-146.

［4］Gill R，Qua S C，Moffat A C.High-performance liquid chromatography of paraquat and diquat in urine with rapid sample preparation involving ion-pair extraction on disposable cartridges of octadecyl-silica［J］.J Chromatogr A，1983，255（1）：483-490.

［5］王瑞花，苏少明，秦光明，等.离子对SPE-HPLC法检测生物检材中的百草枯［J］.法医学杂志，2005，21（2）：121-123.

［6］刘菲，勉丽娜，张婧，等.高效液相色谱法测定植物中的百草枯［J］.中国卫生检验杂志，2009，19（6）：1248-1249.

［7］成美容，王园朝，肖亮.毛细管电泳-间接电化学发光法对茶叶中百草枯农药残留的检测［J］.分析测试学报，2009，28（12）：1444-1447.

［8］Castro R，Moyano E，Galceran M T.Determination of quaternary ammonium pesticides by liquid chromatographyelectrospray tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2001，914（1／2）：111-121.

［9］张婷，谭家锰，齐宝坤，等.气相色谱一串联质谱法分析尿和血中除草剂百草枯［J］.中国法医学杂志，2009，24（3）：161-163.

［10］Whitehead R D，Montesano M A，Jayatilaka N K，et al.Method for measurement of the quaternary amine compounds

paraquat and diquat in human urine using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr B，2010，878（27）：2548-2553.

［11］Yong M，Jenklns K .河水中的百草枯和敌草快的SPE和LC-MS分析方法［J］.环境化学，2004，23（6）：722-723.

［12］李红梅，孙守威，史谢飞.高效安全的敌草快和百草枯液相色谱分离分析技术［J］.分析化学研究简报，2007，35（10）：1499-1502.

［13］Núñez O，Moyano E，Galceran M T.Solid-phase extraction and sample stacking-capillary electrophoresis for the

determination of quaternary ammonium herbicides in drinking water［J］.J Chromatogr A，2002，946（1／2）：275-282.

［14］赵永信，宋国良，张晶，等.气相色谱／质谱法测定粮食中矮壮素残留［J］.中国卫生检验杂志，2008，18（6）：1064-1066.

［15］Zhou Q X ，Mao J L，Xiao J P，et al.Determination of paraquat and diquat preconcentrated with N doped TiO2

nanotubes solid phase extraction cartridge prior to capillary electrophoresis［J］.Anal Methods，2010，2：1063-1068.

［16］Esparza X，Moyano E，Galceran M T .Analysis of chlormequat and mepiquat by hydrophilic interaction

chromatography coupled to tandem mass spectrometry in food samples［J］.J Chromatogr A，2009，1216（20）：4402-4406.

［17］陈小华，汪群杰.固相萃取技术与应用［M］.北京：科学出版社，2010.136.

［18］Zougagh M，Bouabdallah M，Salghi R，et al.Supercritical fluid extraction as an on line clean up technique for rapid amperometric screening and alternative liquid chromatography for confirmation of paraquat and diquat in olive oil samples［J］.J Chromatogr A，2008，1204（1）：56-61.

［19］邱葵，吴华，张征，等.LC-MS／MS测定患者全血中百草枯的浓度［J］.中国药学杂志，2009，44（16）：1259-1261.

［20］Zou Y，Shi Y，Bai Y，et al.An improved approach for extraction and high-performance liquid chromatography analysis of paraquat in human plasma［J］.J Chromatogr B，2011 ，879（20）：1809-1812.

［21］赵森，张云峰，王炯，等.甲哌啶在大鼠体内的分布研究［J］.中国药科大学学报，2013，449（2）：147-150.

［22］陈璐，邹静，肖洪涛，等.高效液相色谱法测定人血清中百草枯浓度［J］.中国医院药学杂志，2010，30（24）：2091-2094.

［23］Fuke C，Arao T，Morinaga Y，et al.Analysis of paraquat，diquat and two diquat metabolites in biological materials by high-performance liquid chromatography［J］.Leg Med，2002，4（3）：156-163.

［24］Kuo T L.Determination of paraquat in tissue using ion-pair chromatography in conjunction with spectrophotometry［J］.Forensic Sci Int，1987，33（3）：177-185.

［25］Nagata T，Kudo K，Kimura K，et al.Simultaneous determination of paraquat and diquat in human tissues by highperformance liquid chromatography［J］.J Chromatogr B，1993，617（1）：119-123.

［26］张曦，金芬，钱永忠，等.高效液相色谱法串联质谱法测定樱桃番茄中的四种季铵盐农药［J］.食品工业科技，2011，32（6）：394-397.

［27］Kolberg D I，Mack D，Anastassiades M，et al.Development and independent laboratory validation of a simple method for the determination of paraquat and diquat in potato，cereals and pulses［J］.Anal Bioanal Chem，2012，404（8）：2465-2474.

［28］Li W X，Chen M，Chen W T，et al.Determination of mepiquat chloride in cotton crops and soil and its dissipation rates［J］.Ecotoxicol Environ Saf，2012，85：137-143.

［29］Marchese S，Perret D，Bafile E，et al.Pressurized liquid extraction coupled with LC-ESI-MS-MS for the

determination of herbicides chlormequat and mepiquat in flours［J］.Chromatographia，2009，70（5／6）：761-767.

［30］Pateiro-Moure M，Martínez-Carballo E，Arias-Estévez M，et al.Determination of quaternary ammonium herbicides in soils：comparison of digestion，shaking and microwave-assisted extractions［J］.J Chromatogr A，2008，1196-1197：110-116.