昆虫滞育关联差异基因的筛选方法

肖海军，邹 超，陈俊晖，陈丽媛

(江西农业大学 昆虫研究所，江西 南昌 330045)

昆虫逃避不利环境条件有两种基本策略:滞育(diapause)和迁飞(migration)，滞育性害虫容易在本地猖獗危害，迁飞性害虫则常造成异地突然暴发，进而都会给农业生产带来灾难性损失［1-2］。滞育是昆虫生长、发育、繁殖的停滞状态，对昆虫滞育调控机制的解析，一方面有利于加深认识生物发育模式调控基础，另一方面滞育生物学基础研究也可为防治害虫提供新技术，具有重要的理论价值和实践意义，无论是害虫的综合治理还是益虫的合理利用，均离不开对滞育调控机制的系统研究［3-4］。昆虫滞育的环境调控和生理机制研究已有了深入理解［5-6］，有许多研究工作应用果蝇(Drosophila melanogaster)、家蚕(Bombyx mori)等模式昆虫，围绕昆虫发育与滞育的环境调控，生理生态以及促前胸腺激素PTTH、滞育激素DH、性信息素合成激活合成肽PBAN、热休克蛋白Hsps 等在滞育进程中的作用，这些领域相关研究理论框架已经基本形成［7］。迄今，在昆虫中仅极少数基因被证明直接参与了昆虫滞育的调控。如研究证实棉铃虫(Helicoverpa armigera)脂肪体与大脑之间的串扰调控了发育停滞，滞育受到血液传播代谢产物三羟酸(TCA)和大脑中调控中心相互作用的调控［8］。然而，昆虫滞育适应性进化的调控中诱导、维持、解除和滞育后发育各阶段过程中激素、能量、呼吸、生殖代谢的调控基础仍有许多值得关注和深入研究的科学问题［4，9-10］。基于mRNA 大规模测序的转录组研究能够从整体水平研究基因功能、基因结构以及相关代谢途径，从而有助于进一步揭示昆虫滞育过程中能量、激素、呼吸等相关代谢通路中特异表达基因的种类、数量、表达水平。本文从滞育调控差异基因的研究角度，对差异基因的筛选方法的相关研究进行总结梳理，对相关基因的功能研究进展进行了概述，以期为滞育的调控机制研究提供思路和参考。

1 组学手段与昆虫滞育调控研究

近年来，随着黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、家蚕(Bombyxmori)、意大利蜜蜂(Apis mellifera)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、3 种金小峰科寄生峰(Nasoniagiraulti、N.longicornis 和N.vitripennis)、豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)、君主斑蝶(Danaus plexippus)、印度跳蚁(Harpegnathos saltator)、佛罗里达弓背蚁(Camponotus floridanus)、小菜蛾(Plutellaxylostella)和东亚飞蝗(Locusta migratoria)等昆虫全基因组陆续公布，昆虫功能基因组研究正在世界范围内掀起热潮［11-12］。早期滞育调控机制的研究，基本都是选择麻蝇，家蚕等模式昆虫。近来年，国内外滞育研究人员逐渐认识到，选择非模式昆虫开展滞育调控分子机制研究，有可能发现一些在模式昆虫中易于被忽略但十分关键的昆虫滞育调控机制［9］。随着测序技术的发展，利用组学手段(转录组学、基因组学、蛋白质组学)的原理和技术研究生物生命活动运程中内在的调控机制正成为生命科学的发展趋势。组学技术的发展，从转录组学和蛋白质组学方面开展夏季滞育、冬季滞育和非滞育昆虫的调控机制研究将有望得到进一步拓展。2011 年底《Cell》公布的典型迁飞型昆虫君主斑蝶(Danaus plexippus)基因组，编码16 866个基因，这为今后开展鳞翅目昆虫滞育和迁飞适应性进化的研究提供了一个理想基因注释参考模式［13］。

昆虫滞育过程中许多基因的表达具有时空特异性，基因表达分析对于揭示基因功能、了解基因间相互关系，阐明昆虫在逆境胁迫条件下的生理生化调控机制起着至关重要的作用。对昆虫不同滞育类型、昆虫滞育过程中的特定生理阶段中特异表达相关基因进行筛选、鉴定和功能分析，是近年探索昆虫滞育调控分子机制的热点工作。生物体内基因组是遗传信息的储存体，mRNA(转录组)是基因表达的中间体，功能性蛋白质(蛋白质组)是基因功能的执行体。基因表达，首先要转录出mRNA，再翻译成蛋白质，而后控制生物代谢过程。转录组学(transcriptomics)作为一种宏观的整体论方法改变了以往选定单个基因或少数几个基因零敲碎打的研究模式，将昆虫功能基因研究带入了一个全新高速发展的时代［14-15］。目前用于研究差异表达基因的方法主要有差别显示DDRT-PCR［16］、抑制消减杂交SSH［17-18］、构建全长cDNA文库，大规模表达序列标签EST、特制微列阵基因芯片Microarry［19］、RNA-Seq［15］等。

2 滞育调控差异基因的筛选方法

2.1 差异显示反转录PCR

差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)具有操作简单，实验过程快速曾广泛应用，其缺点是可重复性差，假阳性高，扩增产生的cDNA 片断包含的差异表达基因信息量相对较少［20］。棉铃虫蛹滞育解除关联基因的研究中，运用差异显示PCR 方法对相关基因进行筛选，获得了56 个具有差异的cDNA 片段，并且通过RT-PCR 进行验证，发现3 个基因表达量下调，4 个基因表达量上调，7 个差异表达的基因中，FKBP12，esr16 和NADH dehydrogenase 1 alpha sub-complex subunit 6 这3 个基因和已知的功能基因基因有较高的同源性［16］。通过应用mRNA 差异显示PCR 技术对捻转血矛线虫滞育期虫体及同期正常发育的虫体比较研究发现，筛选获得了74 个滞育期差异表达的基因EST，同源性分析表明rps-30、T24F1.2等已被证明参与了秀丽隐杆线虫的滞育形成［21］。

2.2 抑制消减杂交

在未知基因种类和序列的情况下，抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)是寻找翻译水平和转录水平滞育差别表达基因的好方法［7］。应用消减杂交库(SSH)揭示淡色库蚊(Culex pipiens)多个在滞育不同阶段特异表达的基因，如调控压力反应、食物消化和代谢等的基因［17］。应用SSH和qRT-PCR 比较蟋蟀(Allonemobius socius)滞育胚胎与非滞育胚胎，发现8 个候选基因与滞育诱导关联［23］。比较棉铃虫(Helicoverpa armigera)滞育诱导阶段注定滞育和非滞育蛹，应用正向和反向SSH 文库分别获得194 和115 条特异序列，并在mRNA 水平和蛋白水平对特异表达基因进行了验证［23］。在关于葱蝇(Delia antique)的研究中，应用正向和反向SSH 文库，从冬季滞育蛹中和夏季滞育蛹中分别获得89 条和120 条特异序列，并且通过半通量RT-PCR 的验证:18 个基因在冬季的相关表达量和18 个基因在夏季的表达量相当［18］。利用SSH 研究食麻蝇(Sarcophaga crassipalpis)滞育转录组时发现:在滞育表达阶段用northern 杂交分离得到了97 个特异克隆(unique clones)，其中17 个基因上调，1 个基因下调，上调基因的包括了热激蛋白基因，重金属抗性基因，神经肽，结构基因，调控因子等［24］。利用SSH 技术从白纹伊蚊(Aedes albopictus)温带种群成熟卵母细胞(第五阶段)分离RNA，在SSH 文库中或得了438条序列，其中有324 条非冗余序列被鉴定出来［25］。应用抑制性消减杂交技术，以梨小食心虫(Grapholita molesta)滞育和非滞育幼虫为材料，构建滞育与非滞育正、反向差减cDNA 文库，从中筛选滞育相关基因，共获得的128 个滞育特异和132 个非滞育特异的EST 序列。其中，滞育差异表达EST 42 条、非滞育差异表达EST 46 条，对差异表达EST 同源检索后推测，其功能大部分与滞育或非滞育特性相关［26］。但SSH 容易造成信息的缺失及形成非酶切位点区域内的点突变，小缺失与插入不容易被检测，酶切位点少的基因组则无法用SSH 筛选。

2.3 构建全长cDNA 文库

1970 年，构建cDNA 文库已经成为一个研究基因组学的手段。而构建全长cDNA 文库克服了传统cDNA 文库的缺点，大大地减少了基因克隆和功能鉴定的时间。目前运用最多的构建全长cDNA 文库的方法是SMART 法和CAP-trapper 法，SMART 法运用于构建一般质量的cDNA 文库，而CAP-trapper法更倾向于构建高质量的cDNA 文库［27］。研究利用SMART 构建棉铃虫幼虫唾液腺全长cDNA 文库，为筛选棉铃虫于寄主互作信号因子提供基因信息资源［28］。采用SMART 技术合成葱蝇(D.antique)非滞育蛹全长cDNA，将限制性内切酶Sfil 消化后的cDNA 克隆到质粒载体pDNR-LIB，转化入大肠杆菌(DH10B)，获得葱蝇非滞育蛹原始文库，获得库容量为2.3×107个单克隆;随机挑取15 个单克隆，通过PCR 快速鉴定，插入片段大小在0.4～1.2 kb，平均大小在0.9 kb，重组率达100%，构建文库的代表性和重组片段的序列完整性有利于基因的分离筛选［29］。应用同样的方法方法分别构建了高质量葱蝇夏滞育和冬滞育的全长cDNA 文库［30-31］。研究成功构建了木乍蚕(Antheraeapernyi)全长cDNA 文库，从一个新生的雌性蛹的滞育阶段提取全部的RNA，所或得的文库浓度为5×105 cfu/mL，重组率接近95%。从250 个有效的序列中形成了175 个ESTs，其中包含了24 个重叠群(contigs)和151 单克隆(singlets)，23.4%是新ESTs，其中得到ApKK42-BP 基因，在滞育阶段是高表达，可能涉及到蛹滞育解除［32］。

2.4 基因表达序列标签

基因表达序列标签(EST)曾广泛应用于新基因发现，基因表达分析和蛋白质组学，但ESTs 序列通常很短，没有给出完整的表达序列;且低丰度表达基因不易获得。由于EST 是单次测序结果，序列大约2%错误［19］。麻蝇(S.crassipalpis)不同发育阶段的EST 转录组，共获得207 110个EST 序列，平均长度241 bp，所有的reads 组合成20 995个重复片断和31 056个单一序列，比对NR 和NT 数据库，鉴定出11 757个特异基因，这为进一步研究滞育特性、胁迫反应、生殖和免疫提供了一个优秀的研究平台［33］。刚进入滞育与非滞育比较有368 个基因下调(＞2 倍)，336 个基因上调(＞2 倍)，且不同滞育阶段差异表达基因群和上、下调表达的程度明显不同［34］。

2.5 基因芯片技术

基因芯片技术(microarry)分析生物转录组具有高组分、高通量特点。基于定制的蒙大纳果蝇(Drosophila montana)基因芯片，发现101 个与滞育特性、光周期性、繁殖行为、光周期钟和逆境胁迫等关联的候选基因，这为进一步研究蒙大纳果蝇成虫适应北纬地区光周期季节性变换的生殖滞育研究奠定基础;挑选芯片上24 个基因进行了滞育雌虫、繁殖雌虫和幼年雌虫的表达谱分析，发现滞育雌虫与繁殖成虫比较仅Dca(Drosophila cold acclimation gene)基因上调表达，15 个下调表达基因中7 个明显与不同滞育阶段关联，5 个与年龄相关［35］。在芯片表达谱的基础上，挑选与蒙大纳果蝇滞育特性关联的cpo 基因(couch potato gene)进行qRT-PCR 验证表明:与繁殖个体比较，滞育个体cpo 基因明显上调表达［35］。在黑腹果蝇(D.melanogaster)中cpo 基因在胰岛素信号通路和卵黄原蛋白合成的下游调控中起重要作用，进一步研究表明cpo 基因也在滞育调控中起重要作用［20，36］。淡色库蚊(C.pipiens)的cpo 基因在成虫羽化之前，滞育与非滞育个体cpo 基因表达无差异，7 天后滞育成虫cpo 基因明显上调表达［37］。苹果实蝇(Rhagoletis pomonella)滞育解除前后基因芯片表达谱，解析了滞育解除前后Wnt 和TOR 信号通路途径的关键基因表达差异［38］。Cabrera 等［39］应用基因芯片首次比较了智利小植绥螨(Phytoseiulus persimilis)滞育与非滞育成虫转录组差异。由于基因芯片无法同时大量地分析组织或细胞内基因组表达的状况，且芯片技术需要准备特异基因探针，所以有可能漏掉那些未知的、表达丰度不高的、可能是很重要的调节基因［40］。

2.6 RNA 转录组测序

高通量测序技术的出现，基于mRNA 大规模测序的RNA-Seq 已成为转录组学研究差异表达基因的主要手段［41-42］。基于高通量测序的RNA-Seq 技术可检测不同状态下基因mRNA 表达，研究细胞在某一功能状态下含mRNA 的类型与拷贝数;搜寻与功能状态变化紧密相关的重要基因群，因此可以用来筛选控制生物特定性状的目的基因和推断相应未知基因的功能，在整体水平解析基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程的分子机理［43-45］。基于Illumina 或454 高通量测序平台的转录组测序能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，具有定量更准确、可重复性更高、检测范围更广、分析更可靠等特点。除分析转录本的结构和表达水平，RNA-Seq 还能发现未知和稀有的转录本、编码序列单核苷酸多态性(SNP)、剪接变体，并提供等位基因特异的基因表达［37，41，46］。

RNA-Seq 检测样品总的RNA，但细胞中很大一部分RNA 都来自核糖体和线粒体，这就相对限制了其他RNA 的读取数量以及这些RNA 表达水平的准确性。针对RNA-Seq 此缺陷，polyA RNA 选择和核糖体RNA 去除可应用来解决这个问题。这两种方法中，核糖体RNA 去除技术是更经济而有效的方法［46］。相对于传统的芯片杂交平台，RNA-Seq 转录组测序无需设计探针，即可对任意物种的整体转录组进行检测，提供更精确的数字化信号，具有更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具［37，46-48］。

由于测序技术的发展，目前NCBI 的UniGene 数据库已经收集了140 个物种共2 691 966 条序列，其中包含14 种昆虫的转录组数据。其中，除豌豆蚜(A.pisum)和棉蚜(A.gossypii)，缺少其它农业害虫的转录组数据［49］。利用RNA-Seq、Tiling microarray 和cDNA 测序获得了30 个不同发育阶段的果蝇转录组，共鉴定了111，195 个新的功能元件，包括数千个基因，蛋白编码基因、非编码基因的转录本、选择性剪接和RNA 编辑等［50］。在用RNA-Seq 研究白纹伊蚊(A.albopictus)滞育准备期的过程中，运用高通量表达基因分析揭示了滞育准备中内分泌信号、细胞增殖、新陈代谢、能量的产生、微孔结构的主要变化［51］。通过白纹伊蚊(A.albopictus)全基因表达分析，发现滞育阶段早期大量涉及到代谢的基因差异表达，到后期的差异表达逐渐减少，仅脂肪代谢基因的表达在滞育后期是差异显著［52］。

3 蛋白质组学研究

蛋白质组学是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识［53］。结合二维微分凝胶电泳和质谱分析法分析翼蚜外茧蜂(Praonvolucre)滞育型和非滞育型代谢和基因表达不同时发现一系列蛋白质和结构功能发生了改变［54］。在分析草地螟滞育与非滞育幼虫之间的蛋白质差异时利用双向电泳和质谱技术发现:ATP 合酶β 亚基、肌球蛋白重链，微管蛋白β-1 链等五个基因仅存在非滞育幼虫中，肌肉肌球蛋白重链仅存在滞育幼虫中［55］。在对亚洲玉米螟越冬滞育研究中发现，53 个差异蛋白点(表达丰度3 倍以上)中43 个上调表达，7 个下调表达，1 个蛋白点消失，通过MALDI-TOF/TOF 质谱分析法鉴定，成功鉴定11 个蛋白点［56］。运用双向电泳技术，在棉铃虫即将滞育幼虫体中，有37 个蛋白质差异表达，通过MALDI-TOF/TOF 质谱分析法鉴定，成功鉴定28 个差异表达基因［57］。运用相同的技术和方法研究非滞育和注定滞育的蛹的大脑，总共有79 个蛋白质和23 个磷酸蛋白质时存在差异表达的，其中有41 个蛋白质和10 个磷酸蛋白质被成功鉴定［58］。运用蛋白质组学研究小麦吸浆虫各个生长时期(滞育前、越夏滞育、越冬滞育和滞育后)，运用双向电泳技术检测到300 个蛋白点，其中275 个蛋白点在其它的时期都是存在的。越夏滞育、越冬滞育和滞育后期与预滞育相比较，表达丰度在两倍以上的蛋白点分别是91、92 和95 个;这其中，有8 个蛋白点在幼虫的不同时期表达有明显差异，运用MALDI-TOF/TOF 质谱分析法分析:7 个蛋白点被成功得鉴定出来［59］。

4 滞育关联基因的功能验证

RNA 干扰(RNA interference，RNAi)现象是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内相应序列mRNA 发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应基因的功能表型缺失［60］。研究已经证实昆虫体内存在基因沉默现象，通过注射和喂食dsRNA 可抑制靶标基因的表达。生物学相关重要基因表达的抑制，可影响昆虫正常生长发育，甚至产生致死作用，这为研究昆虫基因功能和开发害虫防治新方法开辟了一条新的途径［61］。目前对昆虫进行RNAi 的操作技术已经比较成熟，将dsRNA 或siRNA导入昆虫体内主要有注射、饲喂和组织培养3 种方法。RNAi 技术已广泛应用于昆虫生殖、胚胎发育、生物合成和行为等方面研究［61］。将dsRNA 导入到淡色库蚊(C.pipiens)幼虫体内来检验蚊子脱水的耐性，幼虫先在NaCl 盐水溶液中脱水，再在含有dsRNA 的水溶液中再水化，成功地抑制了热激蛋白Hsp90的表达［62］。在滞育生物学相关领域，应用RNAi 技术抑制麻蝇(S.crassipalpis)Hsp23 和Hsp70 的表达，并未改变其是否进行滞育和滞育期长短，但明显影响低温条件下存活率［63］。应用RNAi 对始红蝽(Riptortuspedestris)光周期钟基因负调控period 基因和正调控cycle 基因进行干涉，可明显破坏破坏其原有节律。干涉period 导致在成虫在滞育诱导的光周期条件下不进入滞育而继续发育，干涉cycle 则诱导成虫在滞育抑制的长光照条件下进入滞育［64］。应用RNAi 技术对始红蝽(R.pedestris)的生物钟Clock 基因进行干扰，影响了昆虫内表皮极化和非极化的交替沉积，并且改变了卵巢发育规律，这表明Clock 基因涉及到光周期响应［65］。运用RNAi 技术，生物钟与光周期诱导滞育之间的联系得到了确定［66］。

5 滞育差异基因的研究展望

目前，昆虫滞育调控分子机制研究领域，多数是基于家蚕、果蝇、麻蝇、淡色库蚊等模式昆虫，主要包括从昆虫滞育过程中特定滞育生理阶段搜索相关的差异表达基因［18，36］或是滞育相关蛋白［18，54，58］;分析、比较了特定基因在滞育进程中、滞育维持与滞育解除阶段、滞育与非滞育型个体中的表达动态［37］;对一些分离到的特定滞育相关基因(如hsp)进行功能鉴定表明，一些滞育诱导的差异表达基因与滞育调控并无直接相关，但影响滞育期间昆虫的抗逆性［63］。少部分滞育相关基因被认为可能参与了滞育发育调控，如淡色库蚊(C.pipiens)生殖滞育中滞育相关基因的鉴定及功能分析表明，脂肪积累相关基因fas-1、fas-3 和fabp、胰岛素受体基因、ILP-1(insulin-like peptides-1)基因、核糖体蛋白基因rpS2 和rpS3a［4，10，18］。但由于昆虫滞育相关基因筛选范围大，模式昆虫的研究有时并不能完全反映重要农业昆虫复杂生物学现象。同时，选择非模式农业昆虫开展滞育调控分子机制研究，有可能发现一些在模式昆虫中易于被忽略但十分关键的昆虫滞育调控机制，而且非模式昆虫的研究成果有望直接应用于农业生产实践中病虫害的防治［10-11，67］。后基因组时代的到来，昆虫功能基因组的研究重心将过渡到基因功能研究，因此，应用RNAi、蛋白质组学、功能基因组学等手段研究调控昆虫滞育等生物学过程的关键基因和蛋白的功能有望获得新的突破。同时，随着测序技术发展，生命科学技术的巨大变革将进一步推动后基因组时代生物信息技术的发展，以促进人们破译基因组所蕴涵的功能信息，诠释生命进化的奥秘。

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