瓜实蝇卵巢的发育阶段及分级

欧阳倩， 莫如江， 吴伟坚

华南农业大学昆虫生态研究室，广东 广州 510642

瓜实蝇Bactroceracucurbitae(Coquillett)又名“瓜蛆”，属于双翅目Diptera实蝇科Tephritidae，是瓜果类蔬菜上较为重要的一种害虫。瓜实蝇起源于印度，广泛分布于东南亚各国、夏威夷和所罗门群岛(Dhillonetal.,2005；Huetal.,2008)，我国主要发生在广东、广西、福建、湖南、云南、贵州、四川、香港、台湾等地(梁广勤等,1989；张全胜,2002)。瓜实蝇寄主范围广，多达100多种，主要危害葫芦科植物,如南瓜Cucurbitapepo(Duch)、苦瓜Momordicacharantia(L.)、黄瓜Cucumissativus(L.)、丝瓜Luffacylindrica(Roemer)、甜瓜Cucumismelo(L.)等(陈海东等,1995；Nishida & Bess,1950)。危害率可达50%以上(陈群航等，2005；张全胜,2002)，造成严重经济损失。

瓜实蝇雌虫以产卵管刺入幼瓜表皮内产卵，幼虫孵化后即钻进瓜内蛀食，老熟后钻出烂瓜，入土化蛹。这些为害习性造成了该虫产卵动态研究的困难。研究瓜实蝇卵巢的发育,一方面可以查清该虫的产卵历期,为分析该虫在田间世代重叠的原因和年发生世代提供依据；另一方面可以通过分析环境因子对该虫生殖方面的影响,为综合治理工作提供新的思路。另外，系统解剖卵巢并确定其发育程度是昆虫种群动态预测预报的重要方法之一(张孝羲等，1979)。

目前，有关双翅目实蝇科昆虫卵巢发育已有一定报道，如油橄榄实蝇Dacusoleae(Gmelin) (Fletcheretal.,1978)、东澳番茄实蝇Bactroceracacuminata(Hering) (Raghuetal.，2003)、加勒比按实蝇Anastrephasuspensa(Loew)(Kendraetal.,2006)和橘小实蝇Bactroceradorsalis(Hendel)(Chouetal.,2012)等。但有关瓜实蝇卵巢发育方面的研究很少，Khanetal.(2007)研究了苦楝叶尘及苦楝复合物配方对瓜实蝇卵巢发育的影响，但该文并未研究瓜实蝇卵巢发育的整个动态过程，亦未对其卵巢发育程度进行分级。本文通过解剖瓜实蝇卵巢，详细观察瓜实蝇雌性内生殖系统结构及卵巢的发育形态，提出瓜实蝇卵巢发育的分级标准，为瓜实蝇生殖生理学方面的研究提供理论基础，并为该虫的预测预报提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

瓜实蝇由广西大学提供。在温度27 ℃、相对湿度75%～80%、光周期14L∶10D的条件下饲养，幼虫、成虫分别喂以南瓜、人工饲料(酵母粉∶蔗糖=3∶1)。待幼虫长为老熟幼虫后，放入辅有60%～70%湿度的砂土杯中化蛹，待羽化后分雌、雄饲养。

1.2 卵巢解剖方法

将瓜实蝇雌成虫置于70%酒精内5～10 min，在体视镜(ZESSIS)下于磷酸盐缓冲生理盐水(pH=7 PBS)中解剖卵巢。先用解剖针将虫固定于内置黑色KT板的培养皿中，左手用镊子夹紧产卵器，右手用解剖针在腹部前端横向剖开成“T”形，拉开体壁，再用昆虫针切断连接卵巢的气管等，将卵巢拉出腹外。

将取出的卵巢置于中性红水溶液(Gryaznov,1995)染色10～20 s。用目镜测微尺分别测量卵巢长、宽值，计算卵巢指数(卵巢指数=卵巢长度×卵巢宽度)(Kendraetal.,2005;Landolt & Davis-Hernandez,1993)。用体视镜观察卵巢形态并拍照，统计卵粒数，同时记载卵巢发育级数。每日定时解剖10头雌虫卵巢，连续观察30 d，然后隔4 d观察1次，接着每10 d解剖1次，共观察80 d。

1.3 数据分析

采用SPSS 10.0软件对数据进行统计分析。采用独立样本t检验分析卵粒数之间的差异显著性，卵巢长度、卵巢宽度和卵巢指数均经过log(x+1)转换后进行方差分析，多重比较采用Duncan′s新复极差法。

2 结果与分析

2.1 雌性生殖器的形态特征

瓜实蝇的雌性生殖系统由1对卵巢(ovary)、2根侧输卵管(lateral oviduct)、1根中输卵管(median oviduct)、2个受精囊(spermatheca)、附腺(accessory gland)组成。卵巢左右各1个，由多条卵巢小管(ovarioles)构成。卵巢前端有悬韧带附着于中胸背膈，用于固定卵巢的位置，后端连接侧输卵管。侧输卵管前端与卵巢管连接处，有一个膨大成囊状的卵巢萼(calyx)，可以暂时储存卵。中输卵管是由2条侧输卵管延伸到消化道下方汇合成为一条较粗的管道，连接产卵器。中输卵管顶端延伸出2个接受和贮藏精子的受精囊和2条管状附腺。瓜实蝇产卵后，卵巢末端可以观察到黄色的卵泡遗迹——黄体(corpus luteum)(图1)。

图1 瓜实蝇雌性生殖系统 Fig.1 The reproductive system of a mature (stage 6) female B.cucurbitaea.卵巢; b.侧输卵管; c.中输卵管; d.受精囊; e.附腺; f.黄体。a.Ovary; b.Lateral oviduct; c.Median oviduct; d.Spermatheca; e.Accessory gland; f.Corpus luteum.

2.2 卵巢发育分级

根据Fletcheretal.(1978)的分级方法将瓜实蝇卵巢发育程度分为6个级别。Ⅰ级：卵巢小管纤细，卵母细胞小，未凸出(图2A);Ⅱ级：卵母细胞逐渐进入生长区，形成一系列由小而大的卵室(图2B);Ⅲ级:卵室中的卵母细胞开始沉积卵黄，体积不断增大，呈椭圆形(图2C);Ⅳ级:卵黄体积占到卵母细胞一半以上(图2D);Ⅴ级:抱卵期，卵粒清晰可见，呈香蕉形(图2E)，排列整齐，形成一个类似圆柱形的卵巢,随着卵壳的形成，卵泡细胞和滋养细胞退化(图2F);Ⅵ级:经产期，卵子产出后，卵泡细胞萎缩形成黄体,积累于卵巢萼与侧输卵管中(图2G)。

图2 瓜实蝇雌成虫卵巢发育过程形态的变化Fig.2 Ovarian stages in females of the fruit fly B.cucurbitaeA、B.Ⅰ级、Ⅱ级(卵黄发生前期)；C、D.Ⅲ级、Ⅳ级(卵黄发生期)；E.Ⅳ级向Ⅴ级过渡；F.Ⅴ级(抱卵期)；G.Ⅵ级(经产期)。

由表1可知，卵黄发生前期(Ⅰ级和Ⅱ级),卵巢长度与宽度大致相等，但Ⅱ级卵巢长度和宽度显著大于Ⅰ级。卵黄发生期(Ⅲ级和Ⅳ级)，卵巢长度和宽度迅速增长，且Ⅳ级卵巢长度和宽度显著大于卵黄发生前期和Ⅲ级；卵巢长度增长快于卵巢宽度，Ⅳ级卵巢长度和宽度分别为(1.69±0.130)和(1.35±0.120) mm；卵巢体积显著增大。抱卵期(Ⅴ级)卵巢长度和宽度均达到最大值，分别为(2.18±0.040)和(1.50±0.031) mm。经产期(Ⅵ级)开始产卵，卵巢内卵粒数迅速减少至(10.80±3.450)粒，显著小于Ⅴ级卵粒数[(31.60±1.579)粒]；卵巢长度和宽度逐渐减小，分别为(1.85±0.080)和(1.20±0.066) mm；卵巢宽度和卵巢指数与Ⅳ级基本一致。

2.3 卵巢发育历期

瓜实蝇个体之间的卵巢发育程度差别较大，各级别卵巢的持续时间重叠。如表1所示，Ⅰ级卵巢持续时间较长，羽化后1～8 d均为Ⅰ级卵巢，最长可以持续至羽化后35 d；Ⅱ级卵巢最早出现在羽化后第9天，最长可以持续至羽化后30 d；Ⅲ级卵巢最早出现在羽化后第12天，最长可持续至羽化后70 d；Ⅳ级卵巢最早出现在羽化后第16天；Ⅴ级卵巢最早出现在羽化后第19天，此时平均每雌含卵粒数增加为3.3粒,平均卵巢长度、卵巢宽度和卵巢指数均开始增大(图3);Ⅵ级卵巢最早出现在羽化后第40天，平均每雌含卵粒数开始减少(图3)。Ⅳ级、Ⅴ级、Ⅵ级卵巢最长均持续至羽化后80 d。其中,Ⅰ级卵巢数量最多，占解剖总量的59%，Ⅳ级卵巢数量最少，仅占解剖总量的1%。

表1 瓜实蝇卵巢发育各阶段重要形态参数、实际日龄和含卵粒数Table 1 Ovarian characters, chronological age range and egg load at each developmental stage of B.cucurbitae

*数据为平均值±标准误；同列数据后附相同字母者表示无显著差异(P>0.05, Duncan′s多重比较)。**数据经过log(x+1)转换后进行统计分析，表中显示数据为未经转换的平均值。*Values are mean±SEof morphometric parameters between each oogenesis stage. Same letters within columns indicate no significant difference (P>0.05， Duncan′s mean separation test).**Data were log(x+1) transformed prior to analysis; non-transformed means are shown.

图3 瓜实蝇羽化后80 d卵粒数和卵巢形态参数动态Fig.3 Egg load and ovary characteristics (means and standard errors) of laboratory-reared female B.cucurbitae from adult eclosion to 80 days of age横坐标为发育天数的对数值。Note that the horizontal axes have logarithmic scale.

3 讨论

本文研究了瓜实蝇卵巢发育的分级标准。根据瓜实蝇不同发育时期卵巢小管的形态和卵黄沉积情况可将卵巢发育程度分为4期6个级别，分别为卵黄发生前期(Ⅰ级、Ⅱ级)、卵黄发生期(Ⅲ级、Ⅳ级)、抱卵期(Ⅴ级)、经产期(Ⅵ级)。这与东澳番茄实蝇(Raghuetal.,2003)、加勒比按实蝇(Kendraetal.,2006)和橘小实蝇(Chouetal.,2012)卵巢发育程度的分级标准相一致。Fletcheretal.(1978)将油橄榄实蝇卵巢发育程度划分为4期10个级别。笔者认为，在生产实践中，过于细致的分级会增加工作量，降低工作效率，采用4期6个级别的划分方法即可。

本研究所采用的4个形态参数中，卵巢长度、宽度与卵巢指数均能较好地判定瓜实蝇卵巢处于发生前期或是发生期，而Chouetal.(2012)对橘小实蝇卵巢发育的研究认为卵巢长度为最有效依据。卵黄发生期由滋养细胞的出现至卵粒开始形成，此时大量卵黄沉积于卵母细胞，以至卵巢形态发生巨大变化。卵母细胞的变化与卵巢指数的结合使用可以准确判定未产卵的瓜实蝇卵巢发育级别，这与Kendraetal.(2006)的报道一致。瓜实蝇Ⅰ～Ⅴ级卵巢长度、宽度和卵巢指数均显著增长。Ⅵ级卵巢长度大于Ⅳ级，但卵巢宽度、卵巢指数与Ⅳ级基本一致，因此在实际工作中针对个体仅采用卵巢长度来确定瓜实蝇卵巢发育级别的准确度不高。很多双翅目昆虫产卵后，卵巢中可见黄体，如加勒比按实蝇(Kendraetal.,2006)、橘小实蝇(Chouetal.，2012)，但油橄榄实蝇(Fletcheretal.,1978)中未见。本研究中，Ⅵ级卵巢亦可见黄体，黄体在瓜实蝇卵巢萼中呈块状(图2G)。因此，可以结合黄体判定卵巢所处级别，卵巢长度和黄体是鉴定瓜实蝇卵巢处于经产期(Ⅵ级)的2个关键依据。

瓜实蝇卵巢属于卵母细胞发育不同步、分批产卵的类型。卵巢小管内卵粒成熟后，卵母细胞即开始发育，尽管相邻的卵巢小管中的卵母细胞处于其他级别。油橄榄实蝇、加勒比按实蝇、东澳番茄实蝇、橘小实蝇性成熟后，均有相似的生殖现象(Fletcheretal.,1978;Kendraetal.,2006；Raghuetal.,2003;Vargas & Carey,1990;Vargasetal.,1984)。卵母细胞的迅速发育导致各个卵巢管卵巢发育不同步。

卵巢中成熟卵母细胞的出现被认为是雌虫性成熟的决定因素(Alujaetal.，2001；Nation,1972)。本研究中，瓜实蝇成熟卵母细胞最早出现于羽化后第19天，雌虫全部性成熟则需80 d。而前人研究结果表明，室内饲养的瓜实蝇成虫羽化后6～11 d(肖枢等，2001)、9～11 d(袁盛勇等，2005)、17～10 d(马锞等，2010)即达到性成熟；室外瓜实蝇成虫羽化后4～6 d(王穿才，2009)、12～25 d(张全胜，2009)达到性成熟。瓜实蝇性成熟时间的不同可能与其卵巢发育受飞行行为、营养条件、温度等因素的影响(刘向东等，2003；刘永华等，2006a、2006b)有关。

瓜实蝇的卵常产于幼瓜表皮内，这给田间查卵带来了较大的困难。在田间预测预报中，可以通过解剖颜色粘板诱获的雌虫(薛皇娃和吴伟坚,2013),判定卵巢管发育级别。在生产实践中可参照瓜实蝇卵巢发育状况,结合当地、当时的温度、湿度和光照等因素对瓜实蝇产卵期进行预测预报。

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