PCR 技术在快速检测食源性致病菌中的应用

何维凤

（广西南宁市邕宁区疾病预防控制中心，广西 南宁 530299 E－mail：524417747＠qq.com）

随着生活水平的提高，食品安全问题受到人们越来越多的重视，已经成为社会关注的热点之一。据世界卫生组织（WHO）统计，2005年世界范围内有150万人死于腹泻等疾病，其中有70%为食源性因素造成［1］。在我国食源性疾病暴发事件中，微生物性食物中毒的暴发事件数和患者数最多，占总数的40.09%和61.92%［2］，食源性微生物是导致食源性疾病的主要原因。传统的检测方法繁琐复杂、周期较长，不能实现有效的监测、预防作用，因此快速而准确地检测与鉴定食品中的病原菌是及时有效控制和预防病原菌传播、预防食物中毒的重要前提。

PCR 技术即 聚 合 酶 链 反 应（polymerase chain reaction）是1985 年创立的一种体外酶促扩增特异性片段的方法。该技术自问世以来，就以惊人的速度广泛应用于生命科学的众多领域。目前在食品领域中致病微生物、转基因食品的检测等方面的应用也越来越受关注。笔者对PCR 技术在食源性致病菌快速检测中的应用综述如下。

1 单核细胞增生李斯特菌的检测

李斯特菌广泛存在于自然界中。目前国际上公认的李斯特菌属共有6个种，即单核细胞增多性李斯特菌、伊万诺夫李斯特菌（又称为绵羊李斯特菌）、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、西尔李斯特菌和格氏李斯特菌。其中在李斯特菌属的分类种中，单核细胞增生李斯特菌（简称单增李氏菌）对人类致病性最强，是一种重要的食源性致病菌，它能引起人、畜的李斯特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多等，因此，李斯特菌的检测也受到越来越多的关注。谭炳乾等［3］采用PCR 扩增单核细胞增生李斯特菌的溶血素LLO 编码基因（hly）片段的方法，检测81份冷冻食品中的单核细胞增生李斯特菌，结果与传统的细菌分离方法一致；冯家望等［4］通过建立多重—巢式PCR 联合检测体系快速检测食品中单增李斯特菌，结果多重PCR 的灵敏度达到1×102cfu／ml，巢式PCR 的灵敏度达到1×10cfu／ml，对6类冷冻冷藏食品3 439份样品中的单增李斯特菌进行检测，结果准确，同时有效缩短了检验周期。王耀等［5］应用复合PCR 结合变性高效液相色谱（DHPLC）技术建立食品中单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌和英诺克李斯特菌的快速高通量检测方法，为预防李斯特菌食源性疾病的暴发和流行起到了积极的作用。

2 金黄色葡萄球菌的检测

金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的主要病原菌，也是化脓感染最常见的病原菌之，由金黄色葡萄球菌产生的肠毒素可引起食物中毒、肺炎、心包炎和脑膜炎甚至败血症等相关疾病［6］。从临床分离金黄色葡萄球菌，约1／3产生肠毒素，而且该肠毒素在100 ℃条件下经过30min热处理仍能保持致病性。万婧等［7］选用金葡菌的肠毒素A 基因与金葡菌的种特异性基因nuc作为靶标设计特异性引物，建立水产品中金色葡萄球菌的双重PCR－DHPLC方法，检测240份样品，结果与国标法无显著性差异，同时通过对肠毒素基因的分析，判断出该菌株致病性的强弱；苏明权等［8］根据金黄色葡萄球菌femB 基因序列设计引物和探针建立实时荧光定量PCR 检测金黄色葡萄球菌的方法，检测20 份模拟样品，结果与分离培养符合率为100%；杨玉军等［9］利用多重PCR 扩增金黄色葡萄球菌SEA、SEB、SEC 和SED 基因片段的方法，同时检测金黄色葡萄球菌四型肠毒素基因，比传统PCR 方法省时省力，可以弥补传统PCR法的不足，为快速检测产肠毒素金黄色葡萄球菌及追踪金黄色葡萄球菌食物中毒的源头提供一种检测手段。

3 蜡样芽孢杆菌的检测

蜡样芽孢杆菌是一种革兰阳性杆菌，能形成芽孢，在周围环境中广为存在，为条件致病菌，极易污染食物而引起食物中毒，因此需要发展一种快速的检测方法，把危险菌株从非致病性的菌株中区别开来，如果是传统的培养方法，整个过程可能要5～7d 的时间，对于食物中毒可疑因子的判断及患者的及时治疗影响很大，因此及时快速准确的检测方法应运而生。王振国等［10］以cereolysin AB基因为目的基因设计引物建立SBYR Green l的实时PCR 方法，其最低检出限可达8CFU／ml，且无需电泳可直接对样品进行检测；王红等［11］以溶血素（HBL）基因和非溶血素（NHE）基因为目的基因进行荧光PCR 检测，检测34株蜡样芽孢杆菌溶血素基因，符合率97.1%，从样品的处理到结果的报告耗时仅为2～3h，较传统方法大大缩短了检测周期，为及时处理食物中毒赢取宝贵的时间。

4 沙门氏菌的检测

沙门氏菌是感染人和动物的重要病原菌之一，常污染肉、乳和禽等动物性食品，人体会因为直接接触沙门氏菌或食用被其污染的食物而感染，引起腹泻、呕吐等急性肠胃炎症状，严重的可引起死亡。在世界各国的各类细菌性食物中毒事件中，由沙门氏菌引起的食物中毒常居榜首［12］，目前传统的检测方法费时繁琐，需4～7d才能完成，因此PCR 技术成为沙门氏菌检测研究的热点。钟伟军等［13］根据编码鼠伤寒沙门氏菌肠毒素stn基因的核苷酸序列设计1对引物和荧光探针，建立了荧光定量PCR快速检测食品中沙门氏菌的方法，具有较高的特异性和敏感性；周晓清等［14］选取沙门氏菌的invA 基因为目的基因设计引物建立一步法逆转录荧光定量PCR 检测食源性沙门氏菌，该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点，检测人工污染猪肉中的沙门氏菌与微生物传统计数结果的符合率为100%，并可在5h内完成所有操作，非常适用于食源性沙门氏菌的快速检测。

5 志贺氏菌的检测

志贺氏菌属是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，俗称痢疾杆菌，可通过水和食物传播腹泻和痢疾等疾病，严重危害人们的身体健康，建立志贺氏菌快速准确、实用的检测方法尤为重要。邱杨等［15］根据志贺氏菌ipaH 基因序列设计了特异引物和探针进行荧光PCR，检测样品437份，检测结果与国标法一致；赵丽华等［16］根据ipaH 基因序列，设计引物和分子信标探针，建立志贺氏菌的实时PCR 快速检测技术，检测20份标本，准确率和特异性均为100%，时间约2h，大大缩短了检测周期，可用于志贺氏菌食物中毒快速诊断和食品微生物检测，为食源性疾病的早期、准确诊断提供新的检测手段。

6 致病性大肠杆菌的检测

大部分大肠杆菌是人或动物肠道里的共生菌，但其中也有部分菌株可引起腹泻等疾病［17］，致泻大肠杆菌不但可引起传染性疾病而且可引起食源性疾病的暴发，因此建立快速、简便、准确的检测方法非常重要。郑桂丽等［18］针对大肠杆菌O157 特异基因rfbO157设计引物进行PCR，特异性强，灵敏度高，可在3～4h 内完成对O157的检测，O157 的临床早期诊断和流行病学调查提供了一种较好的手段。胡慧等［19］针对大肠杆菌O157：H7的特异基因rfbE 设计一对特异引物，建立SYBR Green Ⅰ实时定量PCR 检测方法，结果显示所建立的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR 方法可以快速、特异地检测出大肠杆菌O157：H7，细菌纯培养物中其灵敏度可达2×10cfu／ml，临床模拟污染肉样中能最低能检测到1×102cfu／ml的大肠杆菌O157：H7。临床检测肉样500份，检测灵敏度高于常规PCR；徐义 刚 等［20］通 过ETEC LT 基 因、EPEC bfpA 基 因、EHECO抗原基因和EIEC 侵袭性质粒基因序列，设计了4对特异性引物，建立了致腹泻性大肠杆菌多重PCR－DHPLC 检测方法，达到同时检测4 种致病菌的目的；林杰等［21］利用多重PCR 同时检测5种致泻性大肠杆菌8种毒力基因的方法，取得较好的效果。因此多重PCR 的出现达到快速、高通量检测病原微生物的目的。

7 副溶血性弧菌的检测

副溶血性弧菌又称为嗜盐菌，不耐热，是一种嗜盐性革兰氏阴性致病弧菌，常存在于近海水、海产品、盐渍食品中，是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌。人食用污染有该菌的海产品后可引起急性胃肠炎，严重时还可引起败血症，其引发的食源性疾病已成为当前全球面临的公共卫生问题之一。目前，采用MPN 法对食品中的副溶血弧菌进行检测，此方法需要3～7d的时间，且容易出现交叉污染和假阳性。近年来已有林强等［22］以toxR 作为靶基因设计特异性引物及TaqMan探针建立荧光定量PCR 方法，检测178份牡蛎样品，检测到阳性样品168份，最低检测浓度为10cfu／g，最高检出浓度为318 180 cfu／g，灵敏度高于MPN 培养检测法；俞春松［23］选取副溶血性弧菌不耐热溶血毒素基因作为检测的靶片段设计引物及探针，建立检测副溶血性弧菌的荧光定量PCR，检测方法灵敏度为10cfu／ml，检测20份样本，结果符合常规培养检测结果；王小玉等［24］根据副溶血性弧菌种特异性基因不耐热溶血毒素基因tl和直接耐热溶血素毒素基因tdh建立荧光PCR 方法，检测方法灵敏度达10cfu／reaction。该方法大大缩短了检测过程，只需要1h左右，这是包括细菌分离、常规PCR 在内的其它方法所无法比拟的。而且该方法选择了种特异性基因和毒力基因，能够鉴别出分离菌株是否是副溶血性弧菌并进一步判别是否潜在致病，为多重荧光PCR 检测副溶血性弧菌的研究奠定了基础。

8 霍乱弧菌的检测

霍乱为危害严重的夏秋季急性肠道传染病，迄今仍然是发展中国家面临的重大公共卫生问题之一。目前我国霍乱虽已得到有效控制，但发生或流行的潜在威胁依然存在。因此早发现、早诊断是及时控制霍乱疫情蔓延的关键。黄世旺等［25］根据霍乱毒素（cholera toxin，CT）基因序列，在其保守区域设计特异性引物与TaqMan探针，建立特异、灵敏、快速的Taq Man荧光定量PCR 方法用于快速检测霍乱弧菌，检测灵敏度达10 cfu／ml，整个操作过程仅需2h。用该方法检测24份临床腹泻样本，准确率100%，因此该方法可用于霍乱弧菌的日常监测和暴发疫情的应急诊断。杜联峰等［26］根据霍乱毒素ctxA、toxR、O139 群特异性基因、O1 群特异性基因序列设计特异性引物进行多重PCR，建立了稳定可靠的霍乱弧菌多重PCR 检测平台；覃倚莹等［27］分别以rfbM 和wbfR 基因作为O1和O139群霍乱弧菌的模板设计引物和探针，通过优化反应条件建立了能够同时检测O1群O139群霍乱弧菌的二联实时荧光定量PCR 方法（FQ－PCR）。用该方法对10份模拟食品样品和133份临床样品进行了检测，结果表明，该方法特异性为100%；O1群霍乱弧菌和O139群霍乱弧菌检出限分别为92cfu／ml和116cfu／ml；另外该方法对模拟样品和临床样品检测结果与国标法的检测结果完全一致，符合率为100%。因此该实时荧光PCR 检测方法能够同时检测O1和O139群霍乱弧菌，而且特异性好、灵敏度高，能有效克服假阳性，适用于基层疾病控制、口岸检疫单位日常疫情监测和临床诊断。

综上所述，食源性致病菌检测在引入PCR 技术后得以迅速发展，从最初的普通PCR，到各种改良技术的运用，再到荧光实时定量PCR 的出现，多种、多重PCR 的综合应用已成为一种趋势，其高特异性、高敏感度和简便快速，为食物中毒和食源性疾病暴发的应急处置提供了依据。今后，随着经济社会的不断发展，必然会对食源性致病菌的检测提出越来越高的要求，而随着科学技术的不断进步，相信会有更多快速、简便、特异的检测技术得到应用，必定对人类公共卫生、食品安全、营养健康与疾病控制等作出巨大贡献。

［1］ WHO.Food safety and foodbome illness ［EB／OL］.www.who.int／med iac entre／factsheets／fs237／en／，2008.A ccessed September，22，2008.

［2］ 庞璐，张哲，徐进.2006－2010年我国食源性疾病暴发简介［J］.中国食品卫生杂志，2011，23（6）：560－563.

［3］ 谭炳乾，肖军.PCR 在快速检测食品单核细胞增李斯特菌中的应用［J］.湖北农业科学，2009，48（7）：1558－1560.

［4］ 冯家望，吴小，王小，等.多重－巢式PCR 检测食品中单增李斯特菌研［J］.中国国境卫生检疫杂志，2007，30（1）：56－59.

［5］ 王耀，曹际，闫平平，等.食品中3种致病李氏菌MPCRDHPLC检测方法的建立［J］.食品科学，2010，31（8）：158－162.

［6］ 朱穗京，金黄色葡萄球菌感染及治疗现状研究进展［J］.右江民族医学院学报，2012，34（2）：223－224.

［7］ 万婧，周向阳，张晓峰，等.双重PCR－DHPLC 技术快速检测水产品中金黄色葡萄球菌［J］.食品科学，2013，34（6）：199－203.

［8］ 苏明权，杨柳，马越云，等.实时荧光定量PCR 检测金黄色葡萄球菌方法的试验研究［J］.国际检验医学杂志，2010，31（8）：794－796.

［9］ 杨玉军，黄韦唯，王志云，等.多重PCR 快速检测金黄色葡萄球菌四型肠毒素基因的研究［J］.现代预防医学，2009，36（9）：1713－1715.

［10］ 王振国，刘金华，徐宝梁，等.应用实时荧光PCR 检测致病性蜡样芽孢杆菌［J］.生物技术通讯，2006，17（1）：40－42.

［11］ 王红，唐振柱，黄彦，等.荧光检测蜡样芽孢杆菌及溶血素基因应用研究［J］.广西医学，2011，33（7）：885－887.

［12］ 世界卫生组织.食品安全和食源性疾病［EB／OL］.（2007－03）.http：／／www.who.int／mediacentre／factsheets／fs237／zh／index.html.

［13］ 钟伟军，赵明秋，邓中平，等.荧光定量PCR 快速检测食品中沙门氏菌方法的建立及初步应用［J］.中国预防兽医学报，2008，30（3）：220－224.

［14］ 周晓清，李苗云，刘杰，等.一步法逆转录荧光定量PCR检测食源性沙门氏菌［J］.食品科学，2013，34（12）：182－188.

［15］ 邱杨，唐丽霞，赵丽，等.志贺氏菌实时荧光PCR 检测试剂的研制［J］.现代食品科技，2008，24（11）：1151－1154.

［16］ 赵丽华，周勇，万成松.分子信标PCR 检测志贺菌ipaH基因［J］.热带医学杂志，2006，6（5）：499－502.

［17］ Vidal M，Kruger E，Duran C，et al.Single multiplex PCR assay to identify simultaneously the six categories of diarrheagenic Escherichia coli associated with enteric infections［J］.J Clin Microbiol，2005，43（10）：5362－5365.

［18］ 郑桂丽，廖绍安，李钏华，等.大肠杆菌O157特异基因的PCR 检测方法［J］.中国卫 生 检验杂志，2005，15（10）：1183－1185.

［19］ 胡慧，陈雅君，段志刚，等.大肠杆菌O157：H7特异基因的实时荧光定量PCR 检测［J］.食品科学，2011，32（12）：278－282.

［20］ 徐义刚，崔丽春，李苏龙，等.多重PCR－DHPLC 检测4种主要致腹泻性大肠埃希氏菌方法的建立与应用［J］.食品科学，2010，31（20）：293－297.

［21］ 林杰，陈爱平，杨劲松，等.检测致泻大肠杆菌的多重PCR 方法的建立与应用［J］.预防医学论坛，2012，18（12）：881－884.

［22］ 林强，李宁求，付小哲，等.牡蛎中副溶血弧菌荧光定量PCR 检测方法的建立及其应用［J］.中国水产科学，2011，18（1）：96－102.

［23］ 俞春松.荧光定量PCR 检测食品中副溶血性弧菌方法的建立［J］.中国高等医学教育，2010（5）：144－145.

［24］ 王小玉，冯家望，吴小伦，等.实时荧光PCR 方法检测副溶血性弧菌的研究［J］.食品研究与开发，2007，28（6）：135－138.

［25］ 黄世旺，卢亦愚，徐丹戈，等.TaqMan荧光定量PCR 技术快速检测霍乱弧菌方法的建立［J］.中国卫生检验杂志，2006，16（8）：923－924.

［26］ 杜联峰，杨泽，余妍，等.霍乱弧菌多重检测方法的建立及优化［J］.现代预防医学，2010，37（1）：101－102，104.

［27］ 覃倚莹，吴晖，肖性龙，等.Taq－Man实时荧光定量PCR同时检测O1和O139群霍乱弧菌［J］.卫生研究，2010，39（1）：101－105.