原料黄曲霉对牛奶品质的影响

2014-08-15李红瞻辛亚平

中国牛业科学 2014年5期

杨柯，李博，李红瞻，辛亚平＊

（1.汉中市动物卫生监督所，陕西汉中723000；2.现代牧业宝鸡分场，陕西宝鸡722300；3.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100）

随着社会的进步，人们生活水平的提高，牛奶已成为人类重要的营养食品之一，牛奶质量直接关系到牛奶产品的质量和销售，进而影响奶牛场、乳品厂的经济效益。对于牧场来说饲料原料中的黄曲霉毒素不仅对牛只自身造成严重的伤害，而且原料中包含的黄曲霉毒素更能直接在牛乳中体现出来。如果不能及时控制饲料原料中的黄素霉毒素的指标、会直接影响奶牛场的经济效益。只有严格控制住牛奶的质量，才能确保人们的健康及奶牛场的稳定发展。

1 黄曲霉毒素的产生

黄曲霉生长产毒的温度范围是12～42℃。最适产毒温度为33℃，最适水分活性值为0.93～0.98。黄曲霉在水分为18.5%的玉米、稻谷、小麦上生长时，第三天开始产生黄曲霉毒素，第十天产毒量达到最高峰，以后便逐渐减少。菌体形成孢子时.菌丝体产生的毒素逐渐排出到基质中。黄曲霉产毒的这种迟滞现象，意味着高水分粮食如在两天内进行干燥.粮食水分降至13%以下。即使污染黄曲霉也不会产生毒素。

2 黄曲霉毒素的危害

2.1 黄曲霉毒素对人类的危害

黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的代谢产物，至今已分离出的黄曲霉毒素及其衍生物有20多种，黄曲霉毒素是一种强列的肝脏毒。对肝脏有特殊亲和性并有致癌作用。它主要强烈抑制肝脏细胞中RNA的合成，破坏DNA的模板作用，阻止和影响蛋白质、脂肪、线粒体、酶等的合成与代谢。干扰动物的肝功能，导致突变、癌症及肝细胞坏死。同时，饲料中的毒素可以蓄积在动物的肝脏、肾脏和肌肉组织中，人食入后可引起慢性中毒。其中以黄曲霉毒素B1最为多见，危害性也最强，而牛奶检测超标的黄曲霉毒素MI则是黄曲霉毒素Bl的代谢产物。黄曲霉毒素Ml是一种毒性极强的剧毒物质，主要表现在致癌性和致突变性。对人及动物肝脏组织有破坏作用.严重时可导致肝癌甚至死亡。所以黄曲霉毒素1993年被世界卫生组织的癌症研究机构划定为一类致癌物。目前各个国家对各种食品中的黄曲霉毒素Bl以及黄曲霉毒素M1含量都有严格限制。

2.2 黄曲霉毒素对奶牛的危害

奶牛采食含黄曲霉毒素的饲料后多呈慢性经过，犊牛生长发育缓慢，被毛粗糙逆立，食欲不振，磨牙，鼻镜干裂，无目的地徘徊，常一侧或双侧角膜混浊，有间歇性腹泻。有的可导致里急后重和脱肛，犊牛对该毒素较敏感，个别牛还呈现惊恐或转圈运动等神经症状。后期陷入昏迷而死亡，死亡率高于成年牛，成年奶牛对黄曲霉毒素敏感性较高，容易中毒。当出现中毒时，心跳亢进，食欲废绝，精神萎顿，脉搏90次／min，呼吸频数为13次／min以上。体温正常，全身衰弱，行走摇摆，步伐不稳，胃肠膨胀，消化紊乱.初期便秘，后变为下痢。蠕动音消失，可视黏膜苍白，排绿色水样粪便或粪便常伴有肠黏膜。粪便呈灰色，无治疗效果，妊娠牛可发生早产或流产。

3 黄曲霉毒素的检测

目前检测黄曲霉毒素的方法主要有：薄层层析法、高效液相色谱法、以酶联免疫为基础的免疫分析法以及牛物传感器法等，在此基础上将不同方法进行综合应用。黄曲霉毒素B1一般存在于不合格的饲料原料中，而黄曲霉毒素M1则是由于奶牛采食不合格的饲料原料，其中的黄曲霉毒素B1经牛体代谢为M1。

3.1 饲料黄曲霉毒素B1检测

现在牧场饲料黄曲霉检测大部分都是ELISA方法检测、即酶联免疫吸附法。Celer AFLA B1 ELISA试剂盒用竞争性酶联免疫吸附法来测定黄曲霉毒素B1。

3.1.1 检测原理酶联免疫法检测黄曲霉毒素B，的理论基础是抗原抗体反应，酶标微孔板包被有针对黄曲霉毒素抗体的捕获抗体，加入黄曲霉毒素标准或样品溶液、黄曲霉毒素酶标记物和黄曲霉毒素抗体，游离黄曲霉毒素与黄曲霉毒素酶标记物竞争黄曲霉毒素抗体（竞争性酶标免疫分析），同时黄曲霉毒素抗体与捕获抗体连接。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去，将基质／发色剂加入到微孔中孵育，加入反应停止液后，在波长450nm处测量，吸收光强度与样品浓度成反比。

3.1.2 药品及试剂 ELISA试剂盒内含预混合版、微孔板（包被有黄曲霉毒素B1抗体）、黄曲霉毒素B1标准溶液（5瓶1.5mL的黄曲霉毒素B1药物标准溶液，浓度分别为0ppb、1ppb、5ppb、20 ppb、40ppb），酶耦合物、10倍浓缩冲洗液、发展液、终止液、蒸馏水、甲醇溶液、氯化钠。

3.1.3 样品处理充分混匀原料样品、细细研碎，称取5g或50g研磨样品、按5∶1加入1g或10g氯化钠，加入25或250mL的用蒸馏水配制的甲醇溶液，充分震荡3min。DDGS不需加入氯化钠，但须震荡15min。

3.1.4 检测步骤待测样品做好标记，建议做平行样；使用多道枪吸取100μL的酶耦合物到每个预混合板中；加50μL的样品和标准液到加好酶耦合物的预混合板中；使用多道枪对预混合板中的液体吸放三次混匀、然后立即取100μL的液体转移到相对应的包被有黄曲霉毒素B1抗体的微孔板中。每次加样必须选用新的枪头，避免感染；

室温下培养10min；稀释了10倍的洗液重复冲洗小孔；使用多道加样枪吸取100μL发展液到每个小孔，室温下培养5min；使用移液枪分别吸取50 μL的终止液到每个小孔中；在450nm光栅的酶标仪下读数。

3.1.5 结果分析根据酶标仪的数据判断饲料中黄曲霉毒素的含量，企业内控标准为：小于10为合格，10～15为限量使用，大于15表明原料中黄曲霉毒素过高超标拒收处理。

3.2 牛奶黄曲霉毒素M1检测

使用双流向酶联免疫法检测牛奶黄曲霉毒素M1。

3.2.1 原理利用酶联免疫竞争原理，样品中残留的黄曲霉毒素M1与定量特异性酶标抗体反应，多余的游离酶标抗体则与酶标板内的包被抗原结合，通过流动洗涤，加入酶显色底物显色后，与标准点比较定性。

3.2.2 试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB／T 6682规定的二级水。黄曲霉毒素M1双流向酶联免疫试剂盒，2℃～7℃保存。包括黄曲霉毒素M1系列标准溶液，酶联免疫试剂颗粒，抗黄曲霉毒素M1抗体，酶结合物，酶显色底物。

3.2.3 仪器和设备样品试管，带有密封盖，内置酶联免疫试剂颗粒。移液器，450μL±50μL。酶联免疫检测加热器，40℃±5℃，双流向酶联免疫检测读数仪。

3.2.4 分析步骤

①加热器预热到45℃±5℃，并至少保持15min。

②液体试样或乳粉试样复原后振摇混匀，移取450μL至样品试管中，充分振摇，使其中的酶联免疫试剂颗粒完全溶解。

③将样品试管和酶联免疫检测试剂盒同时置于预热过的加热器内保温，保温时间5min～6min。使试样中的黄曲霉毒素M1和酶联免疫试剂颗粒中的酶标记黄曲霉毒素M1抗体结合。

④将样品试管内的全部内容物倒入试剂盒的样品池中，样品将流经“结果显示窗口”向绿色的激活环流去。

⑤当激活环的绿色开始消失变为白色时，立即用力按下激活环按键。

⑥试剂盒继续放置在加热器中保温保持4 min，使显色反应完成。

⑦将试剂盒从加热器中取出水平放置，立即进行检测结果判读，结果判读应在1min内完成。

3.2.5 结果分析目测判读结果，试样点的颜色深于质控点，或两者颜色相当，检测结果为阴性。试样点的颜色浅于质控点，检测结果为阳性。双流向酶联免疫检测读数仪判读结果；数值≤1.05，显示Negative，检测结果为阴性；数值＞1.05，显示Positive，检测结果为阳性；阳性样品需用第一法定量检测方法进一步确认。

4 饲料黄曲霉毒素的控制措施

4.1 饲料原料的采购入场管理

原料采购是饲料企业产品质量优劣的第一关。想要提高奶牛场经济效益、必须从牛奶质量做起、想要做好牛奶质量、就必须要从饲料原料做起。采购入场的饲料原料的好坏直接影响到奶牛健康及牛奶质量、从而影响到牧场的经济效益。收购原料时必须选择质量可靠地供应商；原料入场前必须检验原料的质量。符合企业收购的标准方可入场允以卸货。

4.2 饲料原料入场后的贮存

原料贮存也是一个重要问题，如果仓库漏水、阴暗、潮湿、老鼠出没就很容易促使黄曲霉生长，因而影响产品质量。在原料贮存中，一定要注意空气、湿度、温度等的控制，要严格按照“先进先出”的使用原则，要及时清理已被污染的原料。可使用的方法有：控制贮存环境的温度、封闭隔氧贮存、气调贮存、低温通风贮存及辐射法。

4.3 库存原料的检测

定期对牧场库存的原料做抽检，以免贮存时间过长后发生霉变等因素对原料质量产生影响。确保质量合格后才能使用。

4.4 合理使用防霉剂

在潮湿和高温季节加工的饲料原料与配合饲料极易发霉，应用防霉剂，可延长其保质期。常用防霉剂主要是有丙酸或其盐，山梨醇及其盐类，双乙酸钠，延胡索酸等。其中又以丙酸及其盐类（丙酸钠、丙酸钙）应用最广。另外有些防霉剂（如双乙酸钠）还可以提高饲料利用率，改善饲料的适口性，青贮添加剂（如液氨、丙酸、微生物培养物、或酶法青贮）有利于预防霉菌毒素的产生。