抗氧化肽及其抗氧化活性评价方法研究

徐兆刚 董周永 周亚军 徐艳阳

（吉林大学，吉林长春130012）

自Harman提出自由基理论以来，机体氧化产生的自由基与衰老和疾病之间的关系逐渐引起了学者们的注意。很多研究表明，癌症、动脉粥样硬化、关节炎、老年痴呆症等疾病都与自由基有关[1]。Salim等[2]研究发现，机体过氧化能够导致高血压和2型糖尿病。虽然抗氧化剂已在食品工业中广泛应用，但大部分都属于人工合成的，这些抗氧化剂存在很多安全隐患[3]。抗氧化肽具有很强的抗氧化活性，且无毒或低毒，目前已成为世界各国学者们争相研究的热点，而且部分抗氧化肽已经得到初步的应用。本文简要的介绍了抗氧化肽的来源，重点阐述了抗氧化肽抗氧化活性的体外评价方法，分析了实现体外评价方法统一化的可行性，以期为实现抗氧化肽评价标准的统一，提高各研究之间的可比性提供参考。

1 抗氧化肽的主要来源

抗氧化肽的来源可以分为三类：天然抗氧化肽、人工合成抗氧化肽以及蛋白降解产生的抗氧化肽。天然抗氧化肽也叫内源性抗氧化肽，主要是指生物体内天然存在的一类具有抗氧化活性的肽类物质，这类多肽具有清除氧自由基、抑制脂质过氧化的作用。目前能够明确其分子结构并进一步研究其抗氧化机理的天然抗氧化肽主要有肌肽和谷胱甘肽等[4]。

人工合成抗氧化肽是指利用化学合成、酶法合成以及生物工程技术等途径制成的抗氧化肽。此类抗氧化肽的合成具有定向性，利用固相、液相合成法或合成酶的催化作用等，以氨基酸、小肽等为原料，定向合成目标抗氧化肽。

利用蛋白降解产生抗氧化肽是抗氧化研究领域的一个热点，它是利用动植物蛋白降解产生抗氧化肽，其方法主要有：酸碱水解法、酶水解法以及发酵法。目前采用发酵法来生产抗氧化肽的研究较少，酸碱水解法也已逐渐被淘汰，而酶解法因其条件比较温和，副产物少，安全性高且产物活性好等原因应用较多，相对比较成熟。

2 抗氧化活性的评价方法及混合肽各组分间的相互作用关系

2.1 抗氧化活性的评价方法

2.1.1 常用方法

目前，已经建立的评价物质抗氧化活性的方法有很多，研究者们可以利用这些方法便捷地评价抗氧化物质本身的以及经过消化吸收后在细胞内的抗氧化能力[5]。现行的体外抗氧化力的评价方法主要有：清除自由基的能力、抑制脂质过氧化的能力、还原力的测定以及螯合金属离子的能力。

目前国内外运用较多的测定自由基清除能力的方法是：氧自由基吸收量（ORAC）的测定、ABTS法、DPPH法、羟自由基法，超氧阴离子自由基法等。ABTS和DPPH体系产生的自由基较稳定，但因其自由基在生物体内并非自然存在，为使实验结果更具准确性，现在越来越多的使用ORAC法。

检测抑制脂质过氧化能力的方法主要有：硫代巴比妥酸（TBAS）法、亚油酸自氧化法（又称硫氰酸铁法）、电子自旋共振法。其中硫代巴比妥酸法较常用，其主要原理是利用TBAS与脂质过氧化反应的最终产物丙二醛（MDA）作用生成粉红色物质，在532～535nm处有最大吸收，通过测定MDA含量，在一定程度上反映脂质过氧化的程度。

还原力的测定，通常被用来评价天然抗氧化物的提供氢原子或者提供电子的能力，具有较高还原力的物质通常具有较好的供电子能力[6]，因此，物质的还原力通常被看作是评价其抗氧化活力的重要指标。目前检测还原力的方法主要有对亚铁还原力（FRAP）的测定和对钼还原力的测定。

螯合金属离子能力的检测方法目前主要有螯合铁离子法和螯合铜离子法等。在正常机体内，亚铁离子可以催化氧离子转化为毒性更强的氢氧根离子，当有螯合剂存在时，亚铁离子被螯合，减缓了这一过程。Kim等[7]研究胃肠消化蛋白产生的抗氧化肽时指出其抗氧化活性与螯合金属离子有关。因此，评价抗氧化物的螯合能力可以间接地评价其抗氧化性能。此外，还有一些常用方法，如结晶紫法、亚硝基R盐钴离子褪色法、2-脱氧-D-核糖法、邻苯三酚（焦性没食子酸）的自氧化法等。

上述体外评价方法均属于化学方法，而生物体内氧化过程极其复杂，因而导致在采用上述方法评价时，显示较好抗氧化效果的肽未必在生物体内能取得良好的抗氧化效果。因此，在化学方法评价的基础上需进一步结合生物试验进行评价，常用的方法主要有：抑制肝脏线粒体脂质过氧化检测法、抑制双氧水诱导的红细胞溶血能力实验、抑制蛋白质羰基生成法、质粒DNA氧化损伤实验等。如严群芳[8]利用动物体外试验研究大豆抗氧化肽的抗氧化性，结果表明大豆抗氧化肽能显著减少红细胞自氧化溶血的发生，对小鼠肝组织匀浆自发性及亚铁离子或过氧化氢诱导产生的丙二醛有一定的抑制作用，同时还能极显著降低小鼠肝线粒体中脂质过氧化产物的含量，抑制肝线粒体的肿胀。Nazeer等[9]通过小鼠动物试验发现，石首鱼水解产物能够提高细胞内源性抗氧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽转移酶、超氧化物歧化酶的活性。

2.1.2 体外评价方法之间的关系

目前研究者们在评价某种活性肽的抗氧化力时，通常使用多种方法在不同的条件下进行分析，如Zhang等[10]研究发现，酶解水稻胚乳蛋白得到的抗氧化肽可抑制脂质的自氧化，同时还含有明显的DPPH超氧化物及羟自由基清除能力。虽然目前抗氧化肽活性评价方法较多，但这些方法之间存在什么关系，如何选择，尚未有定论，这使得各实验间缺乏可比性，急需统一的抗氧化能力评价标准。赵涛[11]对用凝胶过滤色谱分离葵花籽粕蛋白酶解物所得3个组分的抗氧化性进行测定，结果发现，羟自由基：F2>F3>F1；ABTS 自由基：F2>F3>F1；DPPH 自由基：F2>F3>F1。可以看出这3种测定方法之间可能存在一定的正相关性。You等[12]研究表明蛋清蛋白抗氧化肽（水溶性的低分子量小肽）可以与水溶性的ABTS自由基充分反应，而较难与溶解于有机溶剂中的DPPH自由基反应。由此可以看出ABTS和DPPH法相关性可能较低。郭洋[13]在对高活性蛋清抗氧化肽组分进行活力评价时，采用了ABTS法、DPPH法、FRAP法和ORAC法，根据其测定结果，DPPH、FRAP以及ORAC结果大小顺序一致，只是各组分间差异大小有所偏差，而ABTS与其他三种结果截然相反。刘洪对[14]对五种花生抗氧化肽体外抗氧化活性进行了比较，其结果为，对DPPH自由基清除活性的大小顺序为：PP2＞AP＞FP＞PP1＞NP；还原力大小为：PP2＞AP＞ FP＞PP1＞NP；对铁离子螯合能力大小为：AP＞FP＞PP1＞PP2＞NP；抑制脂质过氧化能力活性能力大小为：PP2＞PP1＞AP＞FP＞NP。可以看出DPPH法和还原力法较接近，呈一定的正相关性。有学者[15]将亚油酸模拟氧化法对ABTS法、DPPH法、亚铁离子螯合能力以及还原能力的测定做线性回归分析，得到亚油酸模拟氧化法对这四种方法的相关性值，结果表明：亚油酸-ABTS为0.3861；亚油酸-DPPH为0.7508；亚油酸-螯合亚铁离子为0.7583；亚油酸-还原力为0.4938。由此可以看出，亚油酸氧化法与螯合亚铁离子的相关性最高，而与ABTS的相关性最低。顾龙建[16]对合成三肽的疏水性指数、化学抗氧化活性、细胞抗氧化活性（CAA）之间做相关性分析，结果表明疏水性指数与DPPH自由基清除能力及还原力呈显著负相关，合成三肽的CAA值与DPPH自由基清除活性及还原力呈显著正相关，基于相同反应机制的抗氧化活性测定方法间呈显著正相关。张明[17]以4种常见的抗氧化剂为试验样品，利用不同的抗氧化检测方法对其抗氧化效果进行评估，并对评估结果进行相关性分析，结果显示各检测法之间相关性较高的可以归纳为三组：结晶紫法、2-脱氧-D-核糖法、TBA法；肝脏线粒体脂质过氧化检测分别与结晶紫法、TBA法、抑制蛋白质羰基化检测、双氧水诱导红细胞溶血法有很好相关性；清除DPPH自由基法、亚硝基R盐钴离子褪色法、邻苯三酚自氧化法也有很好相关性。这些方法在抗氧化肽的抗氧化能力检测中是否仍具有这样的相关性还有待于进一步研究。

综上所述，抗氧化肽的抗氧化评价方法之间的确存在着相关性，有些方法之间相关性比较显著，可以通过相关性的大小对评价方法进行分类，从不同类别的评价方法中筛选出具有代表性的方法组成一套通用的评价体系。这样可以对活性肽的抗氧化能力进行全面的评价，各评价方法之间的相关性、分类及其同类别作用机理还有待于进一步的探究。

2.2 混合肽组分间的影响

一直以来，抗氧化肽与其他化学抗氧化剂之间的增效作用被广泛研究，而蛋白降解产生的抗氧化肽是以一种肽的混合物状态出现的，不同抗氧化肽组分之间是否有影响近些年也引起了研究者们的注意。李艳伏[18]的研究结果表明，核桃粕蛋白酶解物经过分离纯化后并没有因为纯度提高而显著的提高抗氧化活性，甚至有的还降低了，而且提纯前对O2-·清除率比对·OH清除率高，而提纯后则相反。这也说明了不同肽之间可能存在相互作用，从而影响其抗氧化性。有学者[15]对一组混合肽的相互作用对总抗氧化能力的影响做了研究，结果表明，自由基清除能力较强的肽与清除能力较弱的肽在特定的情况下有微弱的协同增效的作用（ABTS清除能力），清除自由基能力较强的肽之间在ABTS自由基清除能力评价中几乎都表现出加和或者拮抗作用，没有协同增效作用；而在铁离子还原能力测试中，其协同增效作用，均受主抗氧化剂（其中抗氧化活性较强的物质）浓度的影响，一定条件下产生增效作用；在ABTS体系中有相互作用的混合肽在亚油酸体系中却没表现出增效作用。Saito等[19]研究化学合成的三肽，发现这些三肽之间在亚油酸体系中没有协同增效作用。

综上可知，抗氧化肽之间在还原力测试方面在一定条件下可以产生增效作用，而在ABTS和亚油酸体系中效果不明显。目前国内外对此相关的报道不多，但工业上使用的抗氧化肽多属于混合肽类，因此，混合肽之间相互作用的关系及其作用机理也有待于进一步的研究开发。

3 抗氧化肽的应用及发展趋势

目前国内对抗氧化肽的研究仍处于实验室研究阶段，只有少部分抗氧化肽得到实际应用，其研究开发领域主要集中在食品、医药、饲料以及化妆品等行业。

抗氧化肽在食品中的应用主要是利用其高抗氧化活性以及安全性，尤其是一些抗氧化肽的自由基淬灭能力，对油脂的抗氧化能力，对金属离子的螯合能力不弱于人工抗氧化剂BHA等[20]，从而可以替代传统的抗氧化剂，并且肽类物质，能够被人体所需被吸收，营养价值更丰富。抗氧化肽除了作为抗氧化剂使用外，还可以作为功能因子等用于功能性食品的开发。如游丽君[21]通过研究泥鳅蛋白抗氧化肽，发现泥鳅多肽能够起到抗疲劳的功效，表明可以将其应用到运动型功能饮料中；吴夏花[22]以核桃仁为原料，经实验研究分离出抗氧化活性较好的抗氧化肽并对其进行富集和冷冻干燥制成营养性核桃多肽粉。抗氧化肽在食品中的应用才刚刚起步，仍需要大量的试验和广泛的探索，但前景十分广阔。

在医药方面，虽然已有研究表明一些抗氧化肽对某些与机体氧化相关的疾病具有一定的预防和治疗作用，但目前大都处于实验阶段，尚未进行临床研究，只有极少数如谷胱甘肽、肌肽等被临床应用。如国云华等[23]将还原型谷胱甘肽应用于急性病毒性肝炎的治疗中，治疗效果明显，能有效地改善患者肝功能，减轻患者在用药期间不良的反应。

目前国内外抗氧化肽发展都很迅速，但在抗氧化肽的制备上存在一些问题，如对适宜蛋白酶的选择，控制酶解等关键技术以及活性肽脱苦等问题尚待解决。通过研究比较各评价方法之间的关系，筛选出一套通用的方法是可行的，这将增加各研究之间的可比性，便于抗氧化肽功能的研究，对于实际研究具有重要的意义。目前抗氧化肽与其他非肽类抗氧化剂增效作用研究较多，但混合肽之间的作用关系研究较少，抗氧化肽功能的开发研究，必将成为一个重要的课题。

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